Fas/caspase-8/3和ERK信號(hào)通路在Fas siRNA減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用

潘永露，何淑芳，韓正怡，竇夢(mèng)云，楊 婉，程 潔，陳志武，張 野

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230601；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)指由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默的現(xiàn)象，目前已被廣泛用于探索基因功能和心腦血管疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域[4]。利用脂質(zhì)體作為載體介導(dǎo)小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染不但經(jīng)濟(jì)、方便，而且有很高的轉(zhuǎn)染效率[5]。因此，本研究擬評(píng)價(jià)Fas siRNA對(duì)H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的影響，并探討其心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。健康成年♂SD大鼠，體質(zhì)量(250±50)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(皖)2005-001。大鼠H9c2(2-1)胚胎心肌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 DME/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清、0.25%胰酶消化液(加拿大Wisent公司)；化學(xué)修飾合成的Fas siRNA及siRNA-NC(廣州銳博生物公司)；Lipofectamine RNAiMax、TRIzol(美國Invitrogen公司)；細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(廣州Biosharp公司)；乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FITC Annexin V凋亡試劑盒(美國BD公司)；PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；內(nèi)參β-actin引物、Fas引物(上海生工公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗Fas單克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗caspase-3 單克隆抗體、兔抗ERK單克隆抗體、兔抗GSK-3β單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；兔抗caspase-8單克隆抗體(美國Merck Millipore公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；生物安全柜(中國Haier公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；缺氧小室(加拿大Stem Cell公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；蛋白電泳儀、Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海Tannon公司)；Tecan M1000 酶標(biāo)儀(德國Tecan公司)；Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀(美國Beckman有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備與分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將SD大鼠分為2組(n=4)：假手術(shù)組(Sham組)和I/R組。Sham組大鼠開胸后行冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下穿線，但不結(jié)扎；I/R組開胸后穿線結(jié)扎LAD，進(jìn)行30 min缺血和120 min再灌注。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)Fas、caspase-8/3、ERK、GSK-3β蛋白表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清(FBS)的DME/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，置于37℃、95%空氣-5% CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化約1 min，以1 ∶3的比例傳代，每隔2 d傳代1次。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine RNAiMAX說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，F(xiàn)as siRNA以及其陰性對(duì)照(siRNA-NC)用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋(終濃度均為50 nmol·L-1)，輕柔混勻后室溫放置5 min，將混合物加入各組細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。CY3標(biāo)記的熒光對(duì)照用于觀察siRNA轉(zhuǎn)染效率，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈紅色熒光，當(dāng)siRNA轉(zhuǎn)染效率在70%～80%時(shí)說明能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。 Fas siRNA共有3條鏈，預(yù)實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR和Western blot篩選干擾Fas基因表達(dá)最有效的siRNA鏈，將篩選的Fas siRNA鏈用于正式實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染結(jié)束后按實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。

1.2.4制備心肌細(xì)胞H/R損傷模型 參照文獻(xiàn)[6]介紹的方法，棄去H9c2細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基，加入無血清無糖的缺氧液(139 mmol·L-1NaCl、4.7 mmol·L-1KCl、0.5 mmol·L-1MgCl2、1.0 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1HEPES，pH 7.4)，細(xì)胞置于缺氧小室中，通入95% N2-5% CO2飽和10 min，將缺氧小室放入37℃培養(yǎng)箱中缺氧5 h，然后用含10% FBS的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)1 h。

1.2.5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理 將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、H/R組、Fas siRNA組(H/R+Fas-siRNA)、siRNA陰性對(duì)照組(H/R+siRNA-NC)。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，H/R組制備H/R損傷模型，H/R+Fas-siRNA組和H/R+siRNA-NC組分別轉(zhuǎn)染Fas siRNA和siRNA-NC 24 h后，制備H/R損傷模型。各組結(jié)束以后檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.2.6心肌細(xì)胞活性的檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔104個(gè)，按上述方法進(jìn)行分組及處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(培養(yǎng)基100 μL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定各組吸光度(波長(zhǎng)450 nm)，空白對(duì)照孔為不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)測(cè)定孔吸光度減去空白對(duì)照孔吸光度為H9c2心肌細(xì)胞活力，計(jì)算各組平均值。

1.2.7檢測(cè)LDH活性 接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的H9c2細(xì)胞按照以上進(jìn)行分組及處理后，每組各取40 μL培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，并計(jì)算LDH活性。

1.2.8心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將H9c2心肌細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種6孔培養(yǎng)板，按照以上進(jìn)行分組及處理后，0.25%胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，用500 μL Annexin V binding buffer 重懸細(xì)胞，每組加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI , 混勻后室溫反應(yīng)10～15 min，避光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以單染Annexin-V-FITC細(xì)胞和單染PI細(xì)胞作為基準(zhǔn)參照，每個(gè)樣本獲取20 000個(gè)細(xì)胞，以FCS Express V 3.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.9檢測(cè)Fas mRNA表達(dá)水平 接種于60 mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞按上述分組處理后，棄培養(yǎng)液，4℃預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，每孔加1 mL TRIzol,置于冰上裂解10 min，加200 μL氯仿萃取，12 000 r·min-1、4℃離心15 min，收集上清液400 μL。加400 μL異丙醇混勻,-20℃沉降30 min，12 000 r·min-1、4℃離心15 min。棄盡異丙醇后，加1 mL 75%無酶乙醇洗滌，12 000 r·min-1、4℃離心5 min。留沉淀加40 μL DEPC水溶解，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書進(jìn)行，內(nèi)參β-actin的上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；目的基因Fas的上游引物5′-GTTGGAAAGAACCGAAGGACAA-3′，下游引物5′-CCTCAAAGTAGGCACAGGATGT-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)定為：37℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行，條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s ，60℃ 34 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)設(shè)去離子水為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用StepOne Software v 2.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用2-△△CT法計(jì)算[7]。

1.2.10檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 各組處理結(jié)束后，動(dòng)物組織液氮研磨，細(xì)胞棄培養(yǎng)液后4℃預(yù)冷PBS清洗，胰酶消化后收集細(xì)胞，各加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，15 000 r·min-1、4℃離心10 min，收集上清液，BCA法蛋白定量測(cè)定濃度。各組蛋白質(zhì)樣本按1 ∶1加入2×上樣緩沖液，100℃變性10 min，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含8%脫脂牛奶的TBST封閉液中室溫孵育2 h，TBST液漂洗10 min×3次，加入β-actin(1 ∶500稀釋)、Fas(1 ∶500稀釋)、caspase-3、cleaved caspase-3(1 ∶500稀釋)、caspase-8(1 ∶250稀釋)、ERK(1 ∶500稀釋)和 GSK-3β(1 ∶500稀釋)一抗， 4℃孵育過夜。次日TBST漂洗10 min×3次，加二抗孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次， ECL發(fā)光顯色，采集圖像，Imaging J 1.38e圖像分析軟件進(jìn)行條帶光密度分析。

2 結(jié)果

2.1心肌I/R損傷激活Fas/caspase-8/3及ERK信號(hào)通路Fig 1的Western blot結(jié)果表明，心肌I/R損傷后Fas、cleaved caspase-8/3、p-ERK、p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。說明這些蛋白在心肌I/R損傷中發(fā)揮著作用，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在細(xì)胞水平探究Fas/caspase-8/3和ERK信號(hào)通路在心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用及其機(jī)制。

Fig 1 Expressions of Fas/caspase-8/3 and ERK/GSK-3β protein induced by I/R injury in hearts n=3)

2.2篩選最有效FassiRNA鏈H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察可見大量紅色熒光顆粒(Cy3熒光基團(tuán)標(biāo)記)，隱約可見細(xì)胞形態(tài)，說明成功轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。熒光定量RT-PCR 和Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)as siRNA2組Fas mRNA、蛋白表達(dá)降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見Fig 2。說明Fas siRNA2可有效抑制Fas蛋白的表達(dá)，故后續(xù)選擇Fas siRNA2進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

Fig 2 Transfection efficiency of Fas siRNA and screening ofeffective Fas siRNA in H9c2 cardiomyocytes n=3)

2.3FassiRNA增加H9c2細(xì)胞活力，降低LDH活性和心肌細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，H/R可明顯降低心肌細(xì)胞活力，增加LDH活性(P<0.01)；與H/R組相比，H/R+Fas-siRNA組則明顯增加H/R損傷后心肌細(xì)胞活力，降低LDH活性(P<0.01)，而H/R+siRNA-NC組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3A、3B)。Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組FITC+/PI-區(qū)(右下象限)細(xì)胞明顯增多，提示細(xì)胞早期凋亡明顯增加(P<0.01)；與H/R組相比，H/R+Fas-siRNA組則明顯減輕心肌細(xì)胞早期凋亡(P<0.01)，H/R+siRNA-NC組心肌細(xì)胞凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3C、3D)。說明Fas siRNA通過增加心肌細(xì)胞活力，降低LDH活性和心肌細(xì)胞凋亡來減輕H9c2細(xì)胞H/R損傷。

2.4FassiRNA抑制Fas/caspase-8/3信號(hào)通路激活熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)Fas mRNA、蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；而H/R+Fas-siRNA組則下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Fas mRNA、蛋白，與H/R組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H/R+siRNA-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4A、4C)。說明Fas siRNA可有效抑制Fas基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-8蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；而H/R+Fas siRNA組細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-8蛋白水平下調(diào)，與H/R組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H/R+siRNA-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。caspase-3蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡執(zhí)行蛋白，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白被激活，pro-caspase-3蛋白表達(dá)下降，而cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而H/R+Fas siRNA組則抑制caspase-3蛋白活性，細(xì)胞內(nèi)pro-caspase-3增多，而cleaved caspase-3蛋白水平下降，與H/R組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R+siRNA-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4B、4D)。說明Fas siRNA通過抑制Fas/caspase-8/3信號(hào)通路表達(dá)來減輕心肌細(xì)胞凋亡。

2.5FassiRNA激活ERK信號(hào)通路表達(dá)Fig 5 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)p-ERK及p-GSK-3β蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，而H/R+Fas siRNA組細(xì)胞內(nèi)p-ERK及p-GSK-3β蛋白水平明顯增加，與H/R組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R+siRNA-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Fas siRNA通過激活ERK信號(hào)通路來減輕心肌細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Fas siRNA reduced H/R injury in H9c2 cardiomyocytes n=3)

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是心肌I/R過程中的關(guān)鍵事件，細(xì)胞凋亡可通過兩種途徑，包括Fas死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)生途徑，然后通過caspase家族執(zhí)行。本研究在動(dòng)物水平預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)as/caspase-8/3凋亡信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路參與心肌的I/R損傷，故進(jìn)一步在細(xì)胞水平上用H/R損傷模擬在體I/R模型，更深入研究心肌I/R損傷的作用機(jī)制。

Fas死亡信號(hào)通路在I/R期間是心肌細(xì)胞死亡和心肌梗死的關(guān)鍵[8]。Fas是I型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族成員，F(xiàn)as的天然配體(FasL)是II型跨膜糖蛋白，也屬于TNF家族。在I/R損傷中，F(xiàn)as死亡信號(hào)通路被激活，F(xiàn)asL誘導(dǎo)Fas三聚體化后，在細(xì)胞膜形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，包括帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞一系列特征性變化，這與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、異物排除、腫瘤殺傷等密切相關(guān)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，H9c2心肌細(xì)胞在H/R時(shí)細(xì)胞活力下降，細(xì)胞損傷和凋亡增加，而Fas mRNA和蛋白水平升高，提示Fas表達(dá)上調(diào)可能參與心肌細(xì)胞凋亡；采用Fas siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，心肌細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞損傷和凋亡減少，F(xiàn)as mRNA和蛋白水平下降，提示Fas siRNA減輕心肌細(xì)胞H/R誘發(fā)的細(xì)胞損傷和凋亡。

Fas與FasL結(jié)合后介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，進(jìn)而激活下游的caspase凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)，在I/R中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的過程中扮演重要角色，caspase未被激活時(shí)以酶原形式存在(pro-caspase)，一旦被激活后就剪切成有活性的亞單位(cleaved caspase)。根據(jù)作用不同，分為起始caspase和效應(yīng)caspase兩個(gè)亞類[10]。其中，caspase-8屬于起始caspase，在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。在各種細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激下，死亡受體活化導(dǎo)致起始酶caspase-8和caspase-10的激活，通過細(xì)胞內(nèi)Fas等相關(guān)媒介蛋白調(diào)控，進(jìn)一步激活其下游效應(yīng)分子caspase-3和caspase-7，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11]。caspase-3屬于效應(yīng)caspase，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，通常以非活化的酶原方式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)多種凋亡信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，caspase-3可被激活裂解成分子質(zhì)量17 ku的活性亞單位，切割不同的蛋白底物，發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，caspase-3的活化是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的開始[12]。caspase-8和caspase-3的激活已被證實(shí)是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟，能導(dǎo)致DNA降解和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，H9c2心肌細(xì)胞在H/R損傷中cleaved caspase-8/3蛋白表達(dá)增加，而轉(zhuǎn)染Fas siRNA組cleaved caspase-8/3蛋白表達(dá)減少，提示Fas siRNA通過抑制caspase-8/3蛋白活性，減輕H/R損傷，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Fig 4 Fas siRNA decreased Fas mRNA, protein and caspase-8/3 protein expression in H9c2 cardiomyocytes n=3)

Fig 5 Fas siRNA increased ERK, GSK-3β protein expression in H9c2 cardiomyocytes n=3)

ERK信號(hào)通路是心肌再灌注損傷補(bǔ)救激酶通路，屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族成員，ERK通路激活能減輕心肌I/R損傷[13]。ERK磷酸化后可以抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)活性，導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)關(guān)閉，線粒體內(nèi)凋亡因子的釋放減少，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[14]。本研究在動(dòng)物水平表明，ERK信號(hào)通路在心肌I/R損傷中起作用，進(jìn)一步在細(xì)胞水平證實(shí)ERK及下游的GSK-3β活化可以減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。已有研究表明，F(xiàn)as/caspase與ERK信號(hào)通路間存在相互作用，共同調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平證實(shí)，F(xiàn)as siRNA明顯活化ERK信號(hào)通路，減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，這表明Fas基因表達(dá)可以調(diào)控ERK信號(hào)通路，兩者之間存在緊密的相互聯(lián)系。

本研究通過將外源性的Fas siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡未完全抑制，提示在H9c2細(xì)胞中，F(xiàn)as/caspase-8/3和ERK信號(hào)通路可能是心肌H/R時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，還有其他途徑參與凋亡機(jī)制。至于Fas/caspase-8/3凋亡信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路之間具體的相互作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Fas siRNA能減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控Fas/caspase-8/3和ERK信號(hào)通路有關(guān)，為研究缺血性心臟損傷的機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)和潛在的治療方法。