N-甲基環(huán)丙沙星氟喹諾酮查爾酮類衍生物對人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡和自噬的影響

梁紅霞，余藝華，王 萌，石貞玉，皇甫超申，胡國強，厲永強，劉 彬

(河南大學(xué) 1. 護(hù)理與健康研究所、2. 藥學(xué)院、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

喹諾酮類抗感染藥物是一類細(xì)菌DNA回旋酶的抑制劑。真核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶氨基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與原核生物回旋酶的β亞型具有較高的同源性，中間部分的結(jié)構(gòu)域與原核生物回旋酶的Iα亞基具有較高同源性[1]，這是抗菌氟喹諾酮改造為抗腫瘤化合物的理論依據(jù)[2]。本研究運用電子等排體和拼接原理，應(yīng)用α,β-不飽和酮作為氟喹諾酮碳-3位羧基的生物等排體，設(shè)計合成了一系列溶解性好、分子質(zhì)量較小的的氟喹諾酮類查耳酮結(jié)構(gòu)類似物，并對該類化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，該類衍生物均具有較好的抗腫瘤活性，其中1-環(huán)丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-[2-(3,4,5-三甲氧苯甲?；?-乙烯-1-基]-喹啉-4-(1H)-酮(HGQ7)活性最強(Fig 1)，其IC50值達(dá)4.952 μmol·L-1，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價值。近期已有文獻(xiàn)報道，臨床常用的抗腫瘤藥物能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[3]，多數(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬作用對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用，并能降低化療藥物的療效。抑制細(xì)胞自噬，可增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[4]。但某些抗腫瘤藥物利用自噬作用造成腫瘤細(xì)胞的死亡，并將這種作用稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[5]。因此，自噬現(xiàn)象已成為抗腫瘤藥物研究開發(fā)中需要重視的問題。課題組在對新合成化合物的篩選和研究過程中，發(fā)現(xiàn)多數(shù)氟喹諾酮類衍生物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象。本研究應(yīng)用人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株，對HGQ7抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)自噬的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為該類藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

Fig 1 Structure of 1-cyclopropyl-6-fluoro-7- (4-methyl-piperazin-1-yl)-3-[2-(3,4,5-trimethoxy-benzoyl)-vinyl-1-yl]-quinoliN-4(1H)-one

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，置5%的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 HGQ7由河南大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究所合成，經(jīng)HPLC法測定純度>99%，HP5989A質(zhì)譜儀測得相對分子質(zhì)量為521.23。四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbi公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天試劑公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；氯喹(chloroquine，CQ)、羊抗兔HRP二抗(Santa Cruz公司)；兔抗LC3B多克隆抗體(Sigma公司)；驢抗兔Alexa Flour 488抗體(Abcam公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Ascent)；倒置顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)公司)；BX51熒光顯微鏡(Olympus公司)；高速離心機(jī)(艾本德公司)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)；流式細(xì)胞儀(艾森生物公司)；電泳儀、半干式印跡膜轉(zhuǎn)印儀(六一電子儀器設(shè)備廠)。

1.2方法

1.2.1MTT法測定細(xì)胞存活率 以細(xì)胞數(shù)1.5×107·L-1接種于96孔板，分別加入含HGQ7(0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μmol·L-1)和氯喹的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩至藍(lán)色晶體完全溶解，測定570 nm吸光度(OD)值并計算抑制率，以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無細(xì)胞孔吸光度值為空白對照，按公式計算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入400 μL 1×Binding buffer重新懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，室溫避光靜置15 min。加入10 μL PI染色液，冰浴避光靜置5 min，用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)光波長為488 nm。

1.2.3TUNEL法測定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞以1.5×107·L-1接種于放有蓋玻片的6孔板中，每孔500 μL，設(shè)立HGQ7組(0、1.25、5.0 μmol·L-1)和HGQ7聯(lián)合氯喹組，同時收集細(xì)胞，按試劑盒說明書檢測，應(yīng)用ImageJ計算單位面積細(xì)胞總數(shù)，統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率。

1.2.4間接免疫熒光檢測LC3在BxPC-3細(xì)胞的表達(dá) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液制成6×107·L-1濃度的細(xì)胞懸液，接種多聚賴氨酸預(yù)處理爬片的6孔板，每孔3 mL。24 h后PBS洗滌，4%的多聚甲醛4℃冰箱固定，用含0.5% Triton X-100的PBS室溫?fù)u床孵育5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS洗滌，每片加入LC3抗體(1 ∶50)200 μL，4℃冰箱過夜；加入對應(yīng)的二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔抗體(1 ∶300)200 μL，室溫避光孵育1 h，封片拍照。

1.2.5Western blot法檢測細(xì)胞LC3表達(dá) 取BxPC-3細(xì)胞，低溫提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以20 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉。按1 ∶500濃度稀釋一抗，4℃搖床震蕩孵育過夜，按1 ∶5 000濃度稀釋二抗，室溫?fù)u床震蕩孵育2 h，ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1HGQ7對BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 2的MTT結(jié)果顯示，HGQ7處理BxPC-3細(xì)胞24、48 h，對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P<0.05，P<0.01)，24 h和48 h的IC50分別為4.952 μmol·L-1和4.564 μmol·L-1。

Fig 2 Proliferation inhibition effect ofHGQ7 on BxPC-3 cells n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2HGQ7誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡Fig 3的Annexin V/PI檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為3.17%，HGQ7(1.25、5 μmol·L-1)處理24 h細(xì)胞凋亡率分別為30.82%、59.26%，明顯高于對照組(P<0.01)。Fig 4的TUNEL結(jié)果顯示，隨著HGQ7濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3HGQ7對BxPC-3細(xì)胞自噬的影響Fig 5間接免疫熒光結(jié)果顯示，對照組BxPC-3細(xì)胞質(zhì)中的LC3綠色熒光亮點較弱，不同濃度HGQ7處理后，BxPC-3細(xì)胞熒光亮點明顯增加，表明HGQ7誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞發(fā)生自噬。Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ的表達(dá)量隨HGQ7處理時間延長而增加，在24 h達(dá)到最高，48 h時，LC3-Ⅱ表達(dá)量較之前明顯下降，表明HGQ7具有自噬誘導(dǎo)作用。

2.4氯喹對HGQ7抑制細(xì)胞增殖作用的影響如Fig 7所示，HGQ7及HGQ7聯(lián)合氯喹對BxPC-3細(xì)胞的增殖有抑制作用，在HGQ7低劑量(0.312 5～2.5 μmol·L-1)時，HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于HGQ7單獨處理組；而在HGQ7高劑量(5～10 μmol·L-1)時，HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞增殖抑制率明顯低于HGQ7單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 3 The apoptotic rate of BxPC-3 cells aftertreatment with HGQ7 for 24 n=3)

Fig 4 Induction of apoptosis of BxPC-3 cells treated withHGQ7 for 24 h evaluated by TUNEL assay (×100)

Fig 5 Induction of autophagy of BxPC-3 cellstreated with HGQ7 for 24 h evaluated byan immunofluorescence assay (scale bar=50 μm)

Fig 6 Effects of HGQ7 (5.0 μmol·L-1) onLC3 expressions in BxPC-3 cells n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs0 h group

Fig 7 Proliferation inhibition effect of HGQ7 andCQ on BxPC-3 cells

*P<0.05,**P<0.01vsHGQ7 group

2.5氯喹對HGQ7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響Fig 8結(jié)果顯示，HGQ7(1.25 μmol·L-1)聯(lián)合氯喹組細(xì)胞凋亡率高于HGQ7單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HGQ7(5 μmol·L-1)聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞凋亡率低于HGQ7單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

本研究所選用的氟喹諾酮類化合物是以環(huán)丙沙星為原料，以舒尼替尼(索坦)為模板，利用活性拼接原理，合成11種氟喹諾酮-吲哚類查爾酮目標(biāo)化合物。一般認(rèn)為，經(jīng)改造的喹諾酮類抗腫瘤化合物是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑，與DNA斷裂片段及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，防止DNA再連接，造成DNA損傷[6]。本研究應(yīng)用MTT法檢測新合成的氟喹諾酮類化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，前期共合成此類化合物11種，在不同濃度下對細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制作用，其中HGQ7對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖抑制作用最強，24 h的IC50值達(dá)4.952 μmol·L-1。為了進(jìn)一步觀察HGQ7對胰腺癌細(xì)胞的抑制作用，又設(shè)置了48 h時間點，結(jié)果顯示，在48 h時，IC50值達(dá)4.564 μmol·L-1，說明具有藥物濃度和時間依賴性。TUNEL法進(jìn)一步觀察HGQ7對BxPC-3細(xì)胞的凋亡作用，熒光顯微鏡下觀察到隨著HGQ7濃度升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯上升，凋亡率也明顯增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法的結(jié)果一致，說明HGQ7對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡具有明顯誘導(dǎo)作用。

自噬在真核細(xì)胞的病理生理過程中廣泛存在，自噬細(xì)胞內(nèi)的溶酶體可以對一些受損、錯誤折疊的蛋白質(zhì)以及衰老細(xì)胞器進(jìn)行一系列的分解和再循環(huán)應(yīng)用[7]，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[8]。臨床常用的抗腫瘤藥物能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，多數(shù)自噬作用結(jié)果是對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，但也有部分藥物通過自噬作用加速細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，即所謂的Ⅱ型程序性死亡[9-10]。LC3是自噬的標(biāo)志物，其中LC3-Ⅱ含量與自噬泡的數(shù)量成正比。自噬進(jìn)展過程中，位于自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ和自噬體內(nèi)容物一起由溶酶體酶降解[11]。本實驗選取LC3觀察HGQ7對BxPC-3細(xì)胞自噬的影響，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)檢測LC3的表達(dá)。結(jié)果顯示，HGQ7組反映LC3的綠色熒光斑點明顯高于對照組，斑點主要位于細(xì)胞核附近的細(xì)胞質(zhì)中，其數(shù)量增多、亮度增加，提示細(xì)胞中自噬體數(shù)量增加，說明HGQ7能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。應(yīng)用Western blot對LC3的表達(dá)量作半定量分析，不同時間點的HGQ7濃度均為5.0 μmol·L-1，結(jié)果顯示，與0 h相比，在3、6、12、24 h的LC3-Ⅱ表達(dá)量逐漸增加，明顯高于對照組，但在48、72 h時，LC3-Ⅱ的表達(dá)量呈下降趨勢，說明定位于自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ隨著自噬過程的進(jìn)展進(jìn)入了溶酶體降解的過程。從自噬流的角度來看，自噬體增多有可能是由于自噬體的形成增加，也可能是其清除受阻所致[12]。為了進(jìn)一步了解自噬與細(xì)胞增殖及凋亡的關(guān)系，本實驗應(yīng)用自噬抑制劑氯喹來阻斷自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程[13]。為了有效利用氯喹研究自噬對藥物作用的機(jī)制，前期應(yīng)用MTT法已證明，在6.25 μmol·L-1濃度以下時，氯喹對BxPC-3細(xì)胞增殖的影響不明顯。應(yīng)用MTT法檢測HGQ7單獨處理BxPC-3細(xì)胞48 h，與HGQ7聯(lián)合氯喹處理細(xì)胞48 h后生長抑制率的變化，結(jié)果顯示，在低劑量(0.312 5 ～2.5 μmol·L-1)時，HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞生長抑制率明顯高于HGQ7單獨處理組，而在HGQ7高劑量(5.0 ～10 μmol·L-1)時，HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞生長抑制率明顯低于HGQ7單獨處理組。說明低劑量HGQ7處理BxPC-3細(xì)胞，自噬對細(xì)胞具有保護(hù)作用，而在HGQ7高劑量時，自噬則促進(jìn)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的驗證采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，以不加任何藥物組和單獨氯喹組作為對照，1.25 μmol·L-1的HGQ7聯(lián)合氯喹組細(xì)胞凋亡率高于HGQ7單獨處理組，而5.0 μmol·L-1的HGQ7聯(lián)合氯喹組的細(xì)胞凋亡率較HGQ7單獨處理組低，與MTT結(jié)果相吻合。提示HGQ7對BxPC-3細(xì)胞的作用中，自噬的影響與細(xì)胞凋亡有關(guān)，自噬對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用依化合物濃度不同差別明顯，對其機(jī)制的闡明需進(jìn)一步研究。

Fig 8 Effects of HGQ7 andCQ on apoptosis of BxPC-3 cells n=9)

Representative images were taken(×100), nuclear stain(DAPI, A) and apoptotic stain (TUNEL, B) overlaid. 1: Control;2: CQ (6.25 μmol·L-1) 3: HGQ7 (1.25 μmol·L-1);4: HGQ7(1.25 μmol·L-1)+CQ (6.25 μmol·L-1);5: HGQ7 (5.00 μmol·L-1);6: HGQ7 (5.00 μmol·L-1)+CQ (6.25 μmol·L-1).#P<0.05vsHGQ7 (1.25 μmol·L-1) group;**P<0.01vsHGQ7 (5.00 μmol·L-1) group.

(致謝：本實驗在河南大學(xué)護(hù)理與健康重點實驗室完成，李曉華參與部分實驗工作，特此致謝！)