白花丹素對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響

劉 玉，朱德強(qiáng)，高 薇

(錦州醫(yī)科大學(xué)1. 附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理教研室，遼寧 錦州 121000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)為進(jìn)展性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥為主要病理特征，并逐漸浸潤關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和軟骨下骨質(zhì)，嚴(yán)重可以累及患者全身多個(gè)大小關(guān)節(jié)、器官和系統(tǒng)，發(fā)病率和致殘率較高。大量文獻(xiàn)證實(shí)，滑膜細(xì)胞在RA病程中呈類腫瘤性異常增殖，并侵入到軟骨和骨，產(chǎn)生多種致炎因子，導(dǎo)致軟骨和骨內(nèi)慢性炎癥。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是RA病程中的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，其過度增殖及凋亡不足在關(guān)節(jié)破壞和慢性持續(xù)性炎癥中起關(guān)鍵性作用[1-2]。因此，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)內(nèi)FLSs凋亡，抑制其增殖，在RA的臨床治療中至關(guān)重要。

臨床上多采用來氟米特、甲氨喋呤等免疫抑制劑及靶向生物制劑治療RA[3]，但是其副作用和不良反應(yīng)多，并且生物制劑價(jià)格昂貴，給患者造成了巨大的負(fù)擔(dān)，延誤了疾病的治療。因此，研制高效、副作用小的抗RA新藥勢在必行。近年來，中藥單體得到越來越多的關(guān)注，為治療RA提供了新方法。白花丹素(plumbagin，PLB)的結(jié)構(gòu)見Fig 1，為中藥單體，提取自中藥白花丹根和莖中，已有研究表明，PLB有抗腫瘤[4]、抑制肝纖維化[5]、抑制炎癥[6]、抑菌[7]等多種效應(yīng)，且在低濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒性相對(duì)較小，但有一定的肝毒性[8]。近年來，PLB治療炎癥性疾病的作用受到越來越多的關(guān)注。本研究觀察PLB對(duì)RA患者FLSs凋亡的影響，探討PLB用于RA治療的可行性。

Fig 1 Chemical structural formula of PLB

1 材料

1.1滑膜組織標(biāo)本人滑膜組織標(biāo)本取自錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2016年11月-2017年9月骨關(guān)節(jié)外科，行關(guān)節(jié)鏡滑膜切除的活動(dòng)期RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)切取的病變滑膜組織，患者癥狀符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)1987年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)本采集術(shù)前已獲得患者知情同意。

1.2試劑白花丹素單體(純度97%，CAS號(hào)：481-42-5，產(chǎn)品編號(hào)：P7262，分子質(zhì)量：188.18)、LPS(產(chǎn)品編號(hào)：L2880)購自美國Sigma公司；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)，CAS號(hào)：59-05-2，購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Hyclone公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、GAPDH兔單抗，細(xì)胞凋亡Hoechst 33342染色試劑盒，均購自美國Cell Signaling Technology公司；抗血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecular 1，VCAM-1)兔單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、人 TNF-α ELISA試劑盒、人IL-6 ELISA 試劑盒、ECL Plus試劑盒，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)。

2 方法

2.1RA患者關(guān)節(jié)FLSs的分離及培養(yǎng)將在無菌條件下分離的滑膜組織，浸入含DMEM高糖培養(yǎng)基的離心管，在0.5 h內(nèi)采用酶消化法對(duì)滑膜組織進(jìn)行處理：除去脂肪、纖維組織、血管等，無菌PBS反復(fù)沖洗5次，然后用高溫高壓滅菌的眼科剪將滑膜組織盡量粉碎成2～3 mm3小塊，0.4%Ⅱ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶分別于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化2、0.5 h，加血清終止消化。紗網(wǎng)過濾，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加20% FBS培養(yǎng)基重懸，混勻，接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，余下細(xì)胞長滿后傳代。待傳代3次后，可見長梭形或菱形，呈巢狀生長的FLSs，約占98%以上，取第3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定，第4～7代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2FLSs的鑒定取第3代細(xì)胞接種至6孔板中，每孔預(yù)先鋪好蓋玻片，待每孔細(xì)胞長至約70%時(shí)，吸出培養(yǎng)液， PBS漂洗后，4%多聚甲醛固定液4℃固定過夜，PBS洗去固定液，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，吸盡液體，封閉液封閉1 h，去封閉液，用1 ∶200稀釋的抗VCAM-1一抗置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，PBS洗滌去除一抗，吸盡液體，滴加1 ∶1 000稀釋的二抗，濕盒內(nèi)避光孵育1 h，PBS洗滌3次，避光操作，DAPI避光孵育5 min，PBST洗滌5次，每次5 min，吸盡液體，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3MTT法檢測RAFLSs活力及增殖能力將RA患者第4～7代的FLSs均勻鋪至96孔板，每孔約6×103個(gè)細(xì)胞。置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將其分組：第1組為空白對(duì)照組(Control組)，第2～4組為PLB組(0.5、1.5、3 μmol·L-1PLB處理細(xì)胞)，第5組為模型組(1 mg·L-1LPS處理細(xì)胞)，第6～11組為LPS+PLB處理組(1 mg·L-1LPS+0.5、1.5、3、5、7.5、10 μmol·L-1PLB處理細(xì)胞)，第12組為LPS+MTX處理組(1 mg·L-1LPS+ MTX 1.0 mg·L-1)。藥物作用24 h后，加入MTT溶液，37℃、5% CO2孵育4 h ，輕輕抽掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩溶解甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次,每次每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

2.4ELISA檢測RAFLSs致炎因子的分泌量將第5～7代RA FLSs接種在96孔板，每孔約6×103個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為5組：對(duì)照組、模型組(1 mg·L-1LPS)、LPS+0.5 μmol·L-1PLB組、LPS+3 μmol·L-1PLB組、LPS+1.0 mg·L-1MTX組。24 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，10 000×g離心5 min以去除雜質(zhì)，按照ELISA說明書操作，酶標(biāo)儀檢測各組OD值。根據(jù)繪制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，計(jì)算各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6的濃度。

2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測RAFLSs的克隆形成能力取第4～7代FLSs，鋪6孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞約5×105個(gè)，根據(jù)上述分5組用藥物處理。藥物作用時(shí)間2周，期間每3 d換液1次，并保證藥物濃度不變。然后用PBS輕輕漂洗2次；5%的甲醛固定30 min，PBS輕輕漂洗3次；結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗3次；晾干,相機(jī)拍照。

2.6Hoechst33342染色法觀察RAFLSs細(xì)胞核的凋亡形態(tài)按說明書處理的蓋玻片放入6孔板中，取第4～7代的FLSs，均勻鋪至6孔板內(nèi)，每孔內(nèi)細(xì)胞密度約80%時(shí)，按上述分成5組處理。24 h后吸出孔內(nèi)液體，固定，PBS漂洗，每孔0.5 mL Hoechst 33342染色液染色20 min，PBS輕輕沖洗3次，封片，用熒光顯微鏡隨機(jī)選擇不同區(qū)域觀察并拍照?；盍^強(qiáng)的細(xì)胞胞核為微弱熒光，凋亡細(xì)胞的核呈濃染的藍(lán)色熒光。

2.7流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測RAFLSs凋亡率取第4～7代的FLSs，均勻接種到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分組同上。藥物處理24 h后消化、離心，預(yù)冷PBS重懸，將細(xì)胞密度調(diào)至1×108·L-1，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.8Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)提取細(xì)胞蛋白，各組藥物作用24 h后，消化、離心；RIPA裂解液處理細(xì)胞，4℃、12 000×g離心25 min；按BCA定量說明書進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果配制樣品，樣品100℃水浴5 min；SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，留取目標(biāo)條帶；1%的BSA封閉1 h；一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次；二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1RA患者FLSs形態(tài)鑒定RA FLSs培養(yǎng)2 d觀察到少量散在的FLSs已貼壁(Fig 2A)。1周后有少量集落形成，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞之間有明顯空隙，形態(tài)為長梭形、菱形、三角形(Fig 2B)，換液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d(Fig 2C)傳代，經(jīng)2～3代后細(xì)胞形態(tài)均一，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為長梭形，與相鄰細(xì)胞相互交織，呈巢狀生長，符合FLSs形態(tài)。

3.2RAFLSs細(xì)胞標(biāo)志物鑒定Fig 3的免疫熒光結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)得到的第3代滑膜細(xì)胞標(biāo)志物VCAM-1均呈陽性表達(dá)，而其他組織來源的成纖維細(xì)胞VCAM-1均為陰性表達(dá)，故本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞均為FLSs，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.3PLB對(duì)RAFLSs活力及增殖能力的影響如Fig 4所示，單獨(dú)PLB處理組(0.5、1.5、3 μmol·L-1)與對(duì)照組相比，RA FLSs活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組(1 mg·L-1LPS)相比，LPS+PLB組、LPS+MTX組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，PLB對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力呈濃度依賴性。說明0.5、1.5、3 μmol·L-1PLB對(duì)對(duì)照組細(xì)胞活力無明顯影響，對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞有明顯的抑制作用。PLB對(duì)LPS炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞的抑制率IC50為3.149 μmol·L-1，故選擇濃度為0.5、3 μmol·L-1PLB處理細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以MTX處理細(xì)胞作為陽性對(duì)照。

3.4PLB對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAFLSs致炎介質(zhì)分泌的影響Fig 5的ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組上清中TNF-α、IL-6濃度均明顯增高(P<0.01)，說明造模成功；LPS+PLB處理組及LPS+MTX處理組TNF-α、IL-6水平與模型組相比明顯降低，說明PLB與MTX能抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌。

Fig 2 Synovial fibroblasts isolated by enzyme digestion method in patients with rheumatoid arthritis(×200)

Fig 3 Expression of VCAM-1 in RA FLSs by immunofluorescence staining(×200)

Fig 4 Effect of PLB on viability of RA

1:Control group;2:0.5 μmol·L-1PLB;3:1.5 μmol·L-1PLB;4:3.0 μmol·L-1PLB;5:Model group (1 mg·L-1LPS);6:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;7:LPS+1.5 μmol·L-1PLB;8:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;9:LPS+5.0 μmol·L-1PLB;10:LPS+7.5 μmol·L-1PLB;11:LPS+10 μmol·L-1PLB;12:LPS+MTX(1 mg·L-1).##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

Fig 5 Inhibitory effect of PLB on LPS- induced TNF-α(A)and IL-6 (B) levels in RA

1:Control;2:Model;3:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;4:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;5:LPS+1.0 mg·L-1MTX.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

3.5PLB對(duì)RAFLSs克隆形成能力的影響如Fig 6所示，以對(duì)照組細(xì)胞克隆形成能力為100%，模型組增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，LPS+PLB處理組及LPS+MTX處理組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 6 Effect of PLB on colony-formation ability

1:Control;2:Model;3:LPS+0.5 μmol·L-1PLB;4:LPS+3.0 μmol·L-1PLB;5:LPS+1.0 mg·L-1MTX. A：The density of RA FLSs captured by camera;B:Bar graph of proliferation rate in RA FLSs.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.0 1vsmodel group.

3.6PLB對(duì)RAFLSs凋亡的影響Hoechst 33342染色時(shí)，一般正常細(xì)胞胞核在熒光顯微鏡下觀察呈微弱淡藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核呈致密濃染的亮藍(lán)色熒光。如Fig 7所示，對(duì)照組FLSs核呈微弱熒光，模型組較對(duì)照組胞核熒光更弱，1 mg·L-1LPS+ PLB(0.5、3 μmol·L-1)組較模型組胞核熒光增強(qiáng)，且與PLB濃度呈正比；LPS+MTX處理組細(xì)胞核熒光較模型組增強(qiáng)。各組細(xì)胞凋亡率如Fig 8所示，與模型組相比，LPS+PLB組及LPS+MTX組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.7PLB對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleavedcaspase-3表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，模型組Bcl-2表達(dá)明顯增多 (P<0.01)，Bax、cleaved caspase-3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，不同濃度PLB處理組及MTX處理組Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。LPS+3 μmol·L-1PLB組較LPS+0.5 μmol·L-1PLB組Bax、cleaved caspase-3表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。見Fig 9。

3.8PLB抑制JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Fig 10所示，與對(duì)照組相比，模型組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，不同濃度PLB處理組及MTX處理組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。LPS+3 μmol·L-1PLB組較LPS+0.5 μmol·L-1PLB組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)降低。

Fig 7 Effects of PLB on nuclear morphometry change of RA FLSs(×200)

Fig 8 Effects of PLB on apoptosis of RA

Fig 9 Effect of PLB on expression of Bax,Bcl-2 andcleaved caspase-3 proteins of RA

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 10 Effect of PLB on expression of p-JAK2,p-STAT3proteins of RA

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討論

RA作為一種臨床比較常見的風(fēng)濕性疾病，其病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜炎、血管翳形成，滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生，并能逐漸侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨，最終可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。正常人關(guān)節(jié)滑膜襯里層由1～2層滑膜細(xì)胞構(gòu)成，而RA患者關(guān)節(jié)滑膜襯里層滑膜細(xì)胞可過度增殖成多層。滑膜細(xì)胞主要有FLSs及巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，F(xiàn)LSs呈長梭形[9]，F(xiàn)LSs為RA患者病程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[2]。因此，促進(jìn)FLSs凋亡可以有效減輕RA患者的關(guān)節(jié)炎癥狀，延緩疾病進(jìn)展，降低致殘率。本研究細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生物標(biāo)記物鑒定結(jié)果顯示，在體外分離培養(yǎng)RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)的FLSs呈長梭形，且第3代RA FLSs表達(dá)VCAM-1陽性，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均為RA FLSs。本實(shí)驗(yàn)選用LPS處理RA FLSs以模擬細(xì)胞在患者體內(nèi)的長期慢性炎癥環(huán)境[10]，ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組炎癥介質(zhì)分泌較空白組增多，說明細(xì)胞造模成功，MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，PLB能明顯抑制LPS誘導(dǎo)后的RA FLSs的增殖活力，本研究均在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行。

目前已知的細(xì)胞凋亡通路有多種，線粒體在細(xì)胞凋亡中處于凋亡調(diào)控的重要位置。Bcl-2家族的凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2、Bax、Bcl-xl等都定位于線粒體膜上，它們都能阻止或促進(jìn)線粒體內(nèi)Cyt C的釋放，進(jìn)而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。本研究Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PLB能促進(jìn)細(xì)胞核各種凋亡形態(tài)的產(chǎn)生，流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，PLB能促進(jìn)RA FLSs的凋亡。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明，PLB能抑制RA FLSs中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并使促凋亡蛋白Bax、凋亡下游執(zhí)行因子cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)增加，從而促進(jìn)RA FLSs凋亡。

有研究表明，JAK/STATs信號(hào)通路是重要的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是人體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等許多生理和病理過程的共同通路之一。JAK/STATs信號(hào)通路被激活時(shí)，首先JAK蛋白相互磷酸化，再激活STATs蛋白，其中激活態(tài)的p-STAT3蛋白有明顯抑制FLSs、巨噬細(xì)胞凋亡的作用，與其最密切的上游蛋白即為JAK2[12-14]。經(jīng)證實(shí)，在體外培養(yǎng)的 RA FLSs中，JAK/STATs信號(hào)通路被大量激活，Bcl-2處于高表達(dá)的狀態(tài)，Bax、cleaved caspase-3均處于低表達(dá)水平，在特異性阻斷STAT3通路后，Bcl-2基因及蛋白水平明顯降低，Bax、cleaved caspase-3表達(dá)水平相應(yīng)上升[15]，因此，抑制JAK2/STAT3通路可以促進(jìn)RA FLSs的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PLB處理RA FLSs細(xì)胞后，p-JAK2、p-STAT3蛋白量明顯降低，說明PLB能明顯抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明PLB對(duì)RA FLSs有促凋亡作用，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)，并進(jìn)一步證實(shí)了PLB對(duì)RA的治療價(jià)值。本研究只說明了PLB能夠抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，并通過降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)RA FLSs凋亡，其中具體的聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。目前，已有很多PLB應(yīng)用于其他腫瘤疾病及關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物體內(nèi)研究，為下一步探討PLB作用于RA的信號(hào)通路研究提供了指導(dǎo)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)