下丘腦室旁核膠質(zhì)細胞活化在大鼠炎性痛調(diào)節(jié)過程中的作用

陳彬彬，孟 娜，黃思婷，花景煜，孫國林，陳盼盼，章功良，張詠梅

(1. 江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221002；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞活化參與外周炎癥性疼痛反應(yīng)[1]，而長期以來，膠質(zhì)細胞被認為是神經(jīng)元的間質(zhì)細胞或支持細胞。近年來發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細胞的激活對炎癥性疼痛的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了重要作用，它們的激活可以分泌多種致痛物質(zhì)，增強外周有害刺激激活的神經(jīng)元疼痛信號傳導(dǎo)[2]。小膠質(zhì)細胞是中樞免疫反應(yīng)效應(yīng)細胞，其分支狀突起可即時感知周圍環(huán)境的變化，對腦組織內(nèi)的微小病理變化即發(fā)生強烈反應(yīng)，在自閉癥[3]、阿爾茨海默病[4]、Rett綜合征[5]等神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病中發(fā)揮重要作用，其激活時不僅可以釋放出經(jīng)典的神經(jīng)、膠質(zhì)活性物質(zhì)，還可以釋放出促炎或抗炎細胞因子，并且在疼痛信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用[6]。星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元以及突觸緊密接觸，這不僅可以支持和營養(yǎng)神經(jīng)元，而且在調(diào)節(jié)突觸傳遞過程、神經(jīng)元胞外化學(xué)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[7]。傳統(tǒng)研究認為，慢性疼痛的產(chǎn)生是由于神經(jīng)元可塑性改變引起的外周和中樞敏化作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦室旁核小膠質(zhì)細胞活化可能參與了新生期母嬰分離致成年小鼠內(nèi)臟痛敏反應(yīng)[8]。因此，膠質(zhì)細胞在慢性疼痛易化過程中同樣起著重要作用，而室旁核膠質(zhì)細胞活化參與炎性痛反應(yīng)的研究甚少。

炎癥性疼痛是一種組織損傷性應(yīng)激反應(yīng)，下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)在應(yīng)激及疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[9]。本研究采用完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvannt，CFA)誘導(dǎo)的炎性痛模型，采用免疫熒光方法檢測炎性痛條件下，PVN中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化情況，進一步通過小膠質(zhì)細胞特異性抑制劑米諾環(huán)素作用后，觀察其熱痛行為學(xué)改變，為進一步理解炎性痛的發(fā)病機制及探討室旁核膠質(zhì)細胞活化在炎性痛過程中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年SD大鼠34只，♂，體質(zhì)量230～250 g，由山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節(jié)律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實驗前靜養(yǎng)1周。所有實驗均遵守《實驗動物使用規(guī)范》。

1.1.2試劑與儀器 鈣離子接頭蛋白1(ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba1)抗體(lot:GR264097-1)購自Abcam公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(lot：2110541)購自Millipore；米諾環(huán)素(lot # BCBG8005V)、CFA均購自Sigma。熱痛敏刺激儀(IITC series 8-390)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1.2CFA炎癥性疼痛模型的制備及實驗分組輕輕固定大鼠，用微量注射器吸取100 μL CFA注入大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下，建立炎癥性疼痛模型；生理鹽水對照組于相同位置注射100 μL生理鹽水。模型建立成功的標(biāo)志為大鼠局部出現(xiàn)典型的外周炎癥癥狀，包括注射局部紅、腫以及疼痛表現(xiàn)等，持續(xù)時間超過1周。

將SD大鼠隨機分為兩組：生理鹽水對照組(Control)組，即0.9% NS(100 μL)皮下注射；CFA組即CFA皮下注射，注射部位均為左后肢足底中心皮下。根據(jù)免疫熒光結(jié)果，在CFA炎癥性疼痛模型建立后，對大鼠進行PVN給藥，分為室旁核微量注射生理鹽水(NS)組和給藥(米諾環(huán)素)組，每組6只大鼠，NS組為PVN微量注射0.9% NS 0.5 μL；米諾環(huán)素組為微量注射米諾環(huán)素(0.4 g·L-1)0.5 μL。

1.3PVN注射CFA致炎后d 1、6，大鼠七氟烷吸入麻醉后，頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，30% H2O2清潔顱骨表面，參考Watson &Paxinos大鼠腦圖譜，結(jié)合本課題組對大鼠(230～250 g)PVN核團定位摸索，確定核團坐標(biāo)為：ML=±0.4 mm，AP=-1.4 mm，DV=7.7 mm[9]。用針尖外徑為0.3 mm的微量注射器向核團內(nèi)注射，1 min內(nèi)注射完畢，留針5 min以防藥液反流，統(tǒng)一選取右側(cè)PVN進行注射：米諾環(huán)素(0.4 g·L-1)0.5 μL。注射后0.5、1、2、3、4 h檢測熱痛閾。

1.4熱縮足反射潛伏期(thermalwithdrawallatency,TWL)測定在同一時間段、同一室溫、同一濕度下進行測定。按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15cm×15 cm的有機玻璃箱中，待大鼠在其中適應(yīng)30 min安靜后，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側(cè)。從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間為TWL；光源刺激強度恒定不變，自動切斷時間為25 s，以防止組織損傷。每只動物連續(xù)測定5次，測量間隔3 min，取其中3次比較平穩(wěn)的數(shù)據(jù)平均值為大鼠TWL。

1.5免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測10%水合氯醛(3 mL·kg-1)大鼠腹腔注射麻醉后，灌注取腦，放入4%的多聚甲醛中，于4℃固定4～6 h，然后放入30%蔗糖中大約2 d，待組織塊沉底后，作冰凍冠狀連續(xù)切片，片厚30 μm，切片PBS漂洗后，放入一抗Iba1(1 ∶200)、GFAP(1 ∶200)中，4℃孵育過夜，TBS漂洗3次后，加入相應(yīng)的二抗，避光常溫孵育2 h，TBS漂洗后貼片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察，拍片。Image-Pro Plus軟件分析計算室旁核Iba1和GFAP陽性表達的細胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1CFA炎性痛大鼠PVN小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化情況如Fig 1所示，與對照組相比，CFA炎性痛大鼠PVN小膠質(zhì)細胞于d 1開始明顯活化，于d 14仍處于活化狀態(tài)(P<0.01)；星形膠質(zhì)細胞于d 3開始明顯活化，于d 14同樣處于活化狀態(tài)(P<0.01)。

2.2CFA炎性痛急性期PVN注射米諾環(huán)素對熱痛行為學(xué)的影響CFA炎性痛大鼠于d 1急性期，PVN內(nèi)微量注射小膠質(zhì)細胞特異性抑制劑米諾環(huán)素(0.4 g·L-1)0.5 μL 2 h后，活化的小膠質(zhì)細胞受抑制程度最大，且所需米諾環(huán)素劑量最低(Fig 2A)，因此，認為此劑量為藥物的最適劑量。與NS組相比，米諾環(huán)素組大鼠的TWL于1、2、3 h明顯升高(P<0.05)，于4 h衰減到給藥前水平(Fig 2B)。

2.3CFA炎性痛慢性期PVN注射米諾環(huán)素對熱痛行為學(xué)及膠質(zhì)細胞活化的影響CFA炎性痛大鼠于d 6進入慢性期，PVN內(nèi)微量注射米諾環(huán)素后，與NS組相比，米諾環(huán)素組大鼠的TWL無明顯變化(Fig 3A)；并在給藥后2 h，室旁核小膠質(zhì)細胞活化明顯被抑制，星形膠質(zhì)細胞仍處于活化狀態(tài)(Fig 3B)。

3 討論

以往研究表明，在疼痛調(diào)節(jié)過程中，神經(jīng)元及神經(jīng)環(huán)路發(fā)揮了重要作用，而膠質(zhì)細胞只起著支持、營養(yǎng)神經(jīng)元的作用。然而，最近的研究表明，膠質(zhì)細胞在疼痛調(diào)節(jié)過程中同樣發(fā)揮了重要作用，比如傷害性刺激激活外周感覺神經(jīng)元，進一步傳入脊髓，可致脊髓小膠質(zhì)細胞膜上嘌呤受體P2X4R表達上調(diào)，從而促進胞內(nèi)信號分子傳導(dǎo)，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的釋放，釋放的BDNF可促進脊髓Ⅰ層神經(jīng)元過度興奮，增強疼痛反應(yīng)[10]；星形膠質(zhì)細胞可以通過胞內(nèi)激酶、縫隙連接通道、胞膜受體、轉(zhuǎn)運體以及釋放的炎癥介質(zhì)等，參與疼痛調(diào)節(jié)反應(yīng)，并且這一作用主要與慢性疼痛的維持有關(guān)[11]。

Fig 1 Activation of microglia(A) andastrocytes(B) in PVN in CFA treated rats

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs1 d group;△P<0.05,△△P<0.01vs3 d group

Fig 2 Changes of activation of microglia and TWL afterinjecting microglia specific inhibitor minocycline in PVN onthe 1st day post CFA injection

Fig 3 Changes of TWL and activation of microgliaand astrocytes after injecting minocyclinein PVN on the 6th day post CFA injection

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PVN小膠質(zhì)細胞胞膜上Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)參與新生期母嬰分離致成年小鼠慢性內(nèi)臟痛的過程。這一作用可能和生命早期應(yīng)激致成年小鼠室旁核小膠質(zhì)細胞活化有關(guān)，活化的小膠質(zhì)細胞可以釋放大量IL-1β、TNF-α等炎癥因子，可致大腦區(qū)域性對氧化應(yīng)激產(chǎn)生易感狀態(tài)，敏化促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing factor，CRF)神經(jīng)元，進而激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，參與內(nèi)臟痛敏反應(yīng)[8]。雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞參與疼痛的調(diào)節(jié)有很多報道，但室旁核中表達的膠質(zhì)細胞對炎癥性疼痛的調(diào)節(jié)作用還知之甚少。本研究中，通過CFA足底注射后，可誘導(dǎo)明顯的炎性痛模型，并在急性期d 1，室旁核小膠質(zhì)細胞明顯活化，一直持續(xù)到d 14仍處于活化狀態(tài)；d 3進入亞急性期，室旁核星形膠質(zhì)細胞開始明顯活化，持續(xù)到d 14同樣仍處于活化狀態(tài)，這與有關(guān)報道小膠質(zhì)細胞激活早于星形膠質(zhì)細胞的結(jié)論相一致[12]。實驗于致炎后d 1，室旁核微量注射小膠質(zhì)細胞特異性抑制劑米諾環(huán)素后，小膠質(zhì)細胞活化明顯受到抑制，且可明顯減輕大鼠熱痛敏反應(yīng)，說明小膠質(zhì)細胞參與調(diào)節(jié)了炎癥性疼痛急性期熱痛敏反應(yīng)。致炎后d 6，進入慢性期，室旁核微量注射米諾環(huán)素后，小膠質(zhì)細胞活化同樣明顯受到抑制，但不能明顯減輕大鼠熱痛敏反應(yīng)，而此時星形膠質(zhì)細胞仍處于明顯活化狀態(tài)。因此認為室旁核小膠質(zhì)細胞激活可能主要參與炎性痛敏的形成，而在慢性期小膠質(zhì)細胞仍處于持續(xù)活化狀態(tài)，可能與此時星形膠質(zhì)細胞的持續(xù)活化刺激有關(guān)，同樣持續(xù)活化的小膠質(zhì)細胞也可以通過分泌相關(guān)炎性因子，促進星形膠質(zhì)細胞的持續(xù)激活，且星形膠質(zhì)細胞的持續(xù)激活對炎性痛敏的維持可能更具意義。

PVN在應(yīng)激及疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用[9]，當(dāng)CFA致炎后，外周傷害性刺激激活信號傳入中樞，在急性期，可誘發(fā)PVN小膠質(zhì)細胞活化，活化的小膠質(zhì)細胞可大量釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子或趨化因子，促使室旁核神經(jīng)元激活，導(dǎo)致室旁核對外周炎癥性痛刺激反應(yīng)性增強。在亞急性期，室旁核星形膠質(zhì)細胞明顯活化，活化的星形膠質(zhì)細胞不僅可以分泌炎癥介質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸、乙酰膽堿等，興奮鄰近的神經(jīng)元，而且可以包裹神經(jīng)元突觸，與神經(jīng)元突觸產(chǎn)生有效的直接聯(lián)系，調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸傳導(dǎo)作用[13]。并且當(dāng)疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)激活星形膠質(zhì)細胞時，激活的星形膠質(zhì)細胞可以通過大量的縫隙連接，以鈣波形式向外傳播，激活鄰近或者遠處的星形膠質(zhì)細胞，促使痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放，調(diào)節(jié)疼痛反應(yīng)[14]，這可能與星形膠質(zhì)細胞參與慢性疼痛過程的維持有關(guān)。本研究將為臨床炎性痛的治療提供一定的理論基礎(chǔ)和治療靶點。