積雪草酸通過激活Nrf2抗氧化通路抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化

孟 哲，騰 帥，王 琛，白雪洋，李海禹

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

心肌細(xì)胞肥厚、心肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積是心肌纖維化的典型組織學(xué)表現(xiàn)，并具有不可逆性[1]。氧化應(yīng)激能夠通過促進(jìn)脂質(zhì)、蛋白氧化，破壞細(xì)胞膜完整性，延遲細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心肌成纖維細(xì)胞增殖等途徑，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展[2]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)屬于帽和領(lǐng)(Cap’n’Collar，CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族成員。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，激活的Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合后，上調(diào)下游多個(gè)抗氧化靶基因表達(dá)，包括血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶Ⅰ[NAD(P)H︰quinone oxidoreductase 1，NQO1]等[3]。積雪草酸(asiatic acid，AA)是從多年生草本植物積雪草(Centellaasiatica)中提取的五環(huán)三萜烯類組分，廣泛分布于多種蔬菜和水果中。AA具有抗增殖、抗凋亡、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理學(xué)活性[4-5]。AA已被證實(shí)能通過上調(diào)Nrf2活性，減少氧化產(chǎn)物生成，抑制阿霉素誘導(dǎo)的心臟損害[6]。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHRs)作為壓力誘導(dǎo)心肌纖維化模型，觀察AA的抗纖維化作用，并試圖解釋AA 心血管保護(hù)作用與其抗氧化應(yīng)激藥理學(xué)活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑AA(純度>98%，成都普瑞法生物有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、SOD、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒，購自南京建成生物工程有限公司；兔抗大鼠膠原蛋白I(collagen I，Col I)、纖維黏連蛋白(febronectin，F(xiàn)N)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、血小板活化抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)、Nrf2、HO-1、NQO1、p-Akt、磷酸化糖原合酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、Fyn、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；天狼星紅染色液試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡健康♂SHR和Wky大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～230 g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2017-0005。依據(jù)處理方式不同，將大鼠分為4組：對(duì)照組(Wky)、SHRs組、SHRs+AA組(SHRs+AA 20 mg-1·kg-1·d-1)、AA組(Wky+AA 20 mg-1·kg-1·d-1)，每組10只，連續(xù)灌胃12周。所有大鼠均飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(45±5)%，每天光、暗各12 h，自由飲食進(jìn)水。

1.3大鼠體質(zhì)量(BW)、收縮壓(SBP)、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW)指數(shù)和左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVW/BW)指數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)期間，每2周使用電子體重計(jì)和鼠尾測(cè)壓法，測(cè)定各組大鼠BW和SBP。實(shí)驗(yàn)終末，10%水合氯醛麻醉大鼠，快速取出心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗，濾紙將水分充分吸收。稱量心臟質(zhì)量，小心分離左心室并稱重。將心臟質(zhì)量和左心室質(zhì)量同體質(zhì)量相比，計(jì)算心臟指數(shù)。

1.4大鼠血清SOD、T-AOC活性和MDA含量測(cè)定10%水合氯醛麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清后-80℃冷凍保存。嚴(yán)格按照說明書操作流程，進(jìn)行SOD、T-AOC活性和MDA含量測(cè)定。

1.5天狼星紅染色4%多聚甲醛固定大鼠左心室組織，石蠟包埋并切片。依據(jù)天狼星紅染色液試劑盒操作流程，進(jìn)行天狼星紅滴染。偏光顯微鏡下觀察左心室膠原蛋白沉積情況，膠原蛋白染色呈現(xiàn)紅色或紅棕色。

1.6Westernblot取大鼠心肌組織，使用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液，在低溫環(huán)境下進(jìn)行研磨、充分裂解。核蛋白提取按照核蛋白提取試劑盒說明書操作。4℃、12 000 r·min-1離心15 min，收集組織上清液，使用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。高溫促使蛋白變性后，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉。加入一抗Nrf2 (1 ∶400)、NQO1(1 ∶500)、HO-1(1 ∶500)、p-Akt(1 ∶400)、p-GSK-3β(1 ∶400)、Fyn(1 ∶500)、β-actin(1 ∶4 000)和Histone(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST反復(fù)沖洗。加入二抗，室溫孵育2 h，TBST反復(fù)沖洗。ECL化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1AA對(duì)SHRs大鼠BW、SBP、HW/BW和LVW/BW指數(shù)的影響Tab 1結(jié)果顯示，各組間體質(zhì)量無明顯差別。同對(duì)照組相比，SHRs大鼠SBP、HW/BW 和LVW/BW指數(shù)明顯升高(P<0.01)。給予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周能有效降低SHRs大鼠SBP水平、HW/BW 和LVW/BW指數(shù)(P<0.01)。僅給予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周，不影響SBP水平、HW/BW 和LVW/BW指數(shù)。

2.2AA對(duì)SHRs大鼠心肌組織膠原沉積和ColI、FN、CTGF、PAI-1蛋白表達(dá)的影響如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，SHRs組左心室膠原蛋白沉積水平明顯增高。給予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周能減少左心室膠原蛋白沉積。West-ern blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SHRs組心肌組織Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。給予AA(20 mg-1·kg-1·d-1)處理12周，能降低SHRs大鼠心肌組織Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表達(dá)(P<0.01)。僅給予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周不影響心肌組織膠原沉積和Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表達(dá)。

Fig 1 Effect of AA on collagen deposition (A) and protein expression of Col I,FN,CTGF,and PAI-1 (B) in SHRs

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

Tab 1 Effect of AA on SBP,BW,HW/BW and LVW/BW in different )

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

2.3AA對(duì)SHRs大鼠SOD、T-AOC活性和MDA含量的影響Tab 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SHRs大鼠SOD、T-AOC活性明顯降低， MDA含量明顯增加(P<0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周能提高SHRs大鼠SOD、T-AOC活性，減少M(fèi)DA含量(P<0.01)。僅給予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)處理12周，不影響SOD、T-AOC活性和MDA含量。

Tab 2 Effect of AA on the levels of SOD,T-AOCand MDA in different

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

2.4AA對(duì)SHRs大鼠心肌組織Nrf2活性及NQO1、HO-1蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，SHRs大鼠心肌組織Nrf2核轉(zhuǎn)位水平及NQO1、HO-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周能有效逆轉(zhuǎn)壓力負(fù)荷導(dǎo)致的Nrf2活性降低，以及NQO1、HO-1蛋白合成減少(P<0.01)。僅給予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)處理12周，不影響Nrf2活性及NQO1、HO-1蛋白表達(dá)。

2.5AA對(duì)SHRs大鼠心肌組織Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核轉(zhuǎn)位的影響有研究表明，Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路是Nrf2上游重要的調(diào)控途徑。為了進(jìn)一步探討AA的抗纖維化活性和Nrf2抗氧化通路的關(guān)系，我們測(cè)定了SHRs大鼠心肌組織Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核轉(zhuǎn)位水平。如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，SHRs大鼠心肌組織Akt、GSK-3β磷酸化水平明顯降低，細(xì)胞核內(nèi)Fyn蛋白表達(dá)明顯增加。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干預(yù)12周能明顯逆轉(zhuǎn)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的Akt、GSK-3β磷酸化減少，抑制Fyn核轉(zhuǎn)位增加。僅給予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)處理12周，不影響Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核轉(zhuǎn)位水平。

Fig 2 Effect of AA on Nrf2 activation and protein expression

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

3 討論

心肌纖維化是臨床常見心血管疾病共同的病理學(xué)表現(xiàn)，它集中體現(xiàn)在ECM過度沉積、心肌細(xì)胞病理學(xué)凋亡和心肌成纖維細(xì)胞異常增殖，進(jìn)而造成左心室擴(kuò)張和心功能的明顯下降。心肌纖維化具有不可逆性，至今尚無特效藥物，成為臨床治療的難題[1]。心肌纖維化發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究表明，氧化應(yīng)激與其發(fā)病具有密切關(guān)系[2]。生理?xiàng)l件下，心肌組織內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成處于較低水平，滿足必要的生理活動(dòng)。在病理?xiàng)l件下，尤其是壓力負(fù)荷過重誘導(dǎo)的心肌纖維化過程中，伴隨著心肌肥厚和ECM過度沉積，心肌組織處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡遭到破壞。氧化途徑明顯激活，而抗氧化能力降低，ROS合成明顯增加。進(jìn)而導(dǎo)致蛋白、脂質(zhì)分子和核酸異常氧化，誘發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)異常，破壞細(xì)胞膜的完整性，線粒體功能異常和DNA鏈斷裂，最終引起細(xì)胞功能異常、凋亡和壞死，促進(jìn)纖維化[7]。因此，抑制心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少ROS生成，可能成為逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的治療藥物作用靶點(diǎn)。

Fig 3 Effect of AA on phosphorylation of Akt and GSK-3β,andthe nuclear translocation of Fyn in

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

伴隨著SBP逐漸升高，SHRs心肌組織內(nèi)膠原蛋白沉積和促纖因子的表達(dá)均明顯升高。ECM代謝異常，集中體現(xiàn)于膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成增多和代謝減少，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低和收縮功能障礙，最終造成心臟形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變。CTGF和PAI-1通過促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成增加和抑制金屬蛋白酶活性等途徑，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展。已有研究表明，減少CTGF和PAI-1表達(dá)，能夠一定程度抑制心肌纖維化[8]。AA已被證實(shí)能夠抑制L-NAME誘導(dǎo)的高血壓大鼠主動(dòng)脈弓部膠原蛋白沉積[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，AA干預(yù)能有效減少Col I、FN、CTGF及PAI-1表達(dá)。這預(yù)示著AA可能通過影響ECM，尤其是膠原蛋白的代謝和促纖因子的表達(dá)，發(fā)揮抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化作用。

SOD是心肌組織內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠有效減少ROS生成，清除超氧陰離子，SOD活性水平被認(rèn)為是評(píng)判機(jī)體抗氧化能力重要指標(biāo)。T-AOC可以較為全面地反映心肌組織內(nèi)抗氧化物質(zhì)的總體活性，幫助評(píng)估心肌組織對(duì)ROS清除能力。MDA是細(xì)胞膜過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量是反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平的一個(gè)常用指標(biāo)[2]。前期研究證實(shí)，AA能夠有效抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞SOD活性降低和MDA生成增多[10]。我們發(fā)現(xiàn)，AA干預(yù)能夠有效增強(qiáng)SHRs大鼠心肌組織SOD和T-AOC活性，降低MDA含量。結(jié)果提示，AA可能通過恢復(fù)氧化/抗氧化系統(tǒng)再平衡，增強(qiáng)抗氧化酶活力，減少氧化產(chǎn)物的方式，延緩心肌纖維化進(jìn)展。

Nrf2激活并與保護(hù)性蛋白DNA上游調(diào)節(jié)區(qū)的ARE結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)下游抗氧化物質(zhì)表達(dá)，是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路[3]。Nrf2已被證實(shí)廣泛分布于心臟和血管組織內(nèi)，同心肌組織抗氧化應(yīng)激能力密切相關(guān)。在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Nrf2合成增加，同時(shí)無活性的Nrf2蛋白與其伴侶蛋白Keap1解離，Nrf2進(jìn)入活化狀態(tài)，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，再與ARE結(jié)合，上調(diào)抗氧化相關(guān)基因HO-1、NQO1的表達(dá)，最終起到抗氧化作用。已有研究表明，增強(qiáng)Nrf2抗氧化信號(hào)通路活性，能夠有效減輕糖尿病心肌損害和缺血誘導(dǎo)的心肌重塑[11]。AA被證明能夠通過激活Nrf2，上調(diào)HO-1和NQO1表達(dá)，減少ROS和MDA生成，減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟和腎臟損害[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨SHRs心肌組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平降低，AA干預(yù)能夠促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)抗氧化因子HO-1、NQO1表達(dá)。結(jié)果提示，AA可能通過上調(diào)心肌組織抗氧化能力，減少氧化自由基生成，最終抑制心肌纖維化的發(fā)展。

有研究表明，伴隨GSK-3β磷酸化水平降低，F(xiàn)yn核轉(zhuǎn)位水平明顯提高，進(jìn)而通過限制Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制Nrf2對(duì)下游抗氧化基因的上調(diào)作用[12]。我們發(fā)現(xiàn)，在增強(qiáng)Nrf2活性同時(shí)，AA能夠有效增加SHRs心肌組織內(nèi)GSK-3β磷酸化，并抑制Fyn核轉(zhuǎn)位。為了進(jìn)一步探討AA調(diào)控Nrf2的信號(hào)機(jī)制，我們又觀察了Akt的磷酸化水平。作為GSK-3β磷酸化的上游調(diào)控分子，Akt磷酸化減少也被證實(shí)能夠抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位[13]。我們發(fā)現(xiàn)，AA干預(yù)能夠明顯抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平降低。以上結(jié)果提示，AA可能通過增強(qiáng)Akt、GSK-3β磷酸化，并抑制Fyn核轉(zhuǎn)位，上調(diào)纖維化大鼠心肌組織Nrf2活性。

綜上所述，AA通過激活Nrf2誘導(dǎo)的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，減少SHRs心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌纖維化。同時(shí)，AA的Nrf2活化作用，可能與其對(duì)Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

(致謝：本課題在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)老師及各位參與者！)