秦蜀 陳潤(rùn) 趙曉芳 王勇 向遠(yuǎn)彩 羅國松 周虹 代榮陽 張春燕
西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1肝膽外科,4體檢中心(四川瀘州 646000);西南醫(yī)科大學(xué)2公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)教研室,3肝臟疾病實(shí)驗(yàn)室,5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室(四川瀘州646000)
轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)屬于與 cAMP反應(yīng)元件(CRE)結(jié)合的C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。ATF4是一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子,它的時(shí)序性表達(dá)和活動(dòng)處于嚴(yán)格的細(xì)胞控制之下。ATF4的翻譯受到真核翻譯起始因子2α的調(diào)節(jié)(eIF2α)[2]。在正常情況下,由于半衰期短,ATF4蛋白質(zhì)很快就會(huì)被蛋白酶體降解。在應(yīng)激條件下,eIF2α的磷酸化導(dǎo)致翻譯普遍被抑制,但ATF4 mRNA的翻譯卻顯著上調(diào)[3-4]。ATF4參與多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié),包括細(xì)胞氨基酸代謝、成骨細(xì)胞分化和氧化應(yīng)激反應(yīng)[1,5-7]。體內(nèi)證據(jù)表明ATF4在糖代謝、胰島素敏感性和脂代謝中起著重要作用[8-10]。肝損傷是肝炎、肝硬化、肝癌等多種肝病的共同發(fā)病過程[11]。誘導(dǎo)肝損傷的危險(xiǎn)因素很多,如肝炎病毒、酒精、藥物等。雖然已經(jīng)知道應(yīng)激反應(yīng)等信號(hào)調(diào)控分子可以介導(dǎo)肝臟損傷[12-13],但肝臟損傷的確切機(jī)制仍不清楚。在本實(shí)驗(yàn)研究中,我們觀察到正常小鼠肝臟中應(yīng)激調(diào)控分子ATF4蛋白呈高水平。CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)肝損傷后,肝臟ATF4蛋白水平下降。此外,本研究還證明了CRISPR?Cas9介導(dǎo)的ATF4敲低對(duì)CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有明顯促進(jìn)作用。
1.1 藥品和抗體 衣霉素購自Tocris(Minneapolis,MN,USA);CCl4購自國藥(中國,北京);LPS和D?GalN 購自 Sigma?Aldrich(St.Louis,MO,USA);ATF4、p?eIF2α 和 Bip抗體 購 自 Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA);eIF2α和 GAPDH抗 體 購 自 Santa Cruz Biotechnology(Heidelberg,Germany)。
1.2 動(dòng)物及處理 雄性C57BL/6小鼠20~22 g購自南京大學(xué)動(dòng)物模型研究中心(中國,南京,MARC)。本研究中動(dòng)物的使用已獲單位動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物倫理批號(hào):20160003。
1.3 質(zhì)粒尾靜脈高壓注射 尾靜脈高壓注射按照文獻(xiàn)[14]報(bào)告中所述進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之,ATF4靶向的CRISPR?Cas9 質(zhì)粒或空載體 10 μg稀釋到 2 mL鹽水(0.9%NaCl),經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾,并在5~7 s內(nèi)注入10周大的雄性C57BL/6小鼠的側(cè)尾靜脈。
1.4 CCl4肝損傷模型 如前所述,雄性C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射CCl4(4 mL/kg,以5%濃度在橄欖油中溶解),每周3次,共2周[15]。在最后1次注射CCl4后的24 h后處死小鼠,收集肝臟等組織用于實(shí)驗(yàn)。
1.5 LPS/D?GalN肝損傷模型 雄性C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射LPS(50 μg/kg)和D?GalN(800 mg/kg),在LPS/D?GalN注射后6 h處死小鼠[16],收集肝臟等組織用于實(shí)驗(yàn)。
1.6 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR 根據(jù)制造商的說明,用TRIZOL試劑(Invitrogen)分離總RNA。按照制造商說明,使用M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如前所述,采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,Tokyo,Japan)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析[15]。使用18S對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用的引物如下:小鼠ATF4?forward:TCCTGAACAGCGAAGTGTTG;小鼠 ATF4?reverse:AGAGCT CATCTGGCATGGTT;小鼠 18S?forward:CGGCTACCACATCCAAGGAA;小 鼠 18S?reverse:GCTGGAATTACCGCGGCT。
1.7 Western blot 將小鼠組織溶解到Triton裂解緩沖液中(20 mmol/L Tris、pH 7.4、137 mmol/L Na?Cl、10%glycerol、1%Triton X?100、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L NaF、5 mg/mL抑肽酶、20 mmol/L亮抑酶肽和1 mmol/L原釩酸鈉),4℃離心12 000g15 min。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品在用4×SDS上樣緩沖液(200 mmol/L Tris、pH 6.8,8%SDS、400 mmol/L DTT、0.4%溴酚藍(lán)、40%甘油)100℃變性5 min,如前所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)SDS?PAGE和western blot分析[15]。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel進(jìn)行錄入整理,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組之間比較采用單因素方差分析,對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果再采用LSD法進(jìn)行兩兩比較,以上分析均以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果以±s表達(dá)。采用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 小鼠肝臟中ATF4蛋白呈高表達(dá) 為了研究ATF4在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況,我們檢測(cè)了ATF4在小鼠肝、心、腎、肺組織中的蛋白和mRNA水平。Western blot結(jié)果顯示小鼠肝臟中有明顯的ATF4蛋白表達(dá),而其他組織中幾乎檢測(cè)不到ATF4蛋白表達(dá)(圖1A)。然而,在上述組織中均能檢測(cè)到較高水平的ATF4 mRNA(圖1B)。
圖1 ATF 4蛋白在小鼠肝臟中呈高表達(dá)Fig.1 ATF4 proteins are high in mouse liver
2.2 肝臟中ATF4的高蛋白水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或eIF2α無關(guān) 鑒于ATF4的蛋白水平受控于eIF2α,我們通過Western blot分析了小鼠組織中eIF2α的磷酸化水平。結(jié)果表明,在檢測(cè)的組織中,磷酸化?eIF2α都非常低(圖2A),這提示ATF4在肝臟中的蛋白質(zhì)高水平可能不依賴于eIF2α的磷酸化調(diào)控。為了探明小鼠肝臟ATF4蛋白的高表達(dá)是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān),我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素處理小鼠。如圖2B所示,衣霉素處理導(dǎo)致了XBP1 mRNA剪接,提示誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。其次,我們檢測(cè)了衣霉素處理后小鼠肝臟和肺組織中的eIF2α/ATF4信號(hào)。結(jié)果表明,衣霉素能誘導(dǎo)小鼠肺組織中eIF2α磷酸化、ATF4和Bip蛋白水平的顯著提高(圖2C)。在肝組織中,應(yīng)用衣霉素后,eIF2α磷酸化和Bip表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng),但是,衣霉素處理后ATF4蛋白卻呈時(shí)間依賴性下降(圖2C)。這些結(jié)果提示肝臟ATF4蛋白的高水平與eIF2α和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無關(guān)。
圖2 肝臟中ATF4蛋白的高表達(dá)不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或eIF2α調(diào)控Fig.2 Liver ATF4 proteins are not upregulated by ER stress or eIF2α
2.3 CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中ATF4蛋白質(zhì)水平降低 由于ATF4蛋白在小鼠肝臟中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平,且不受經(jīng)典信號(hào)調(diào)控。本研究進(jìn)一步探討了ATF4在肝損傷中的作用。本研究采用CCl4建立慢性肝損傷模型,LPS/D?GalN建立急性肝損傷小鼠模型。Western blot分析表明,在CCl4模型中,小鼠肝臟ATF4蛋白表達(dá)顯著下降,然而ATF4的mRNA水平無明顯變化(圖3A、B)。見表1。
表1 CCl4組和對(duì)照組肝組織中ATF4 mRNA的表達(dá)比較Tab.1 Comparison of ATF4 mRNA expression in liver tissues of CCl4 group and control group
此外,LPS/D?GalN處理6 h后ATF4蛋白也明顯下降(圖3C),而ATF4的mRNA也無明顯變化(圖3D)。見表2。這些結(jié)果表明,慢性和急性肝損傷誘導(dǎo)ATF4蛋白質(zhì)降低。
圖3 肝臟ATF4蛋白在肝損傷中降低額度Fig.3 Liver ATF4 proteins were decreased in liver injury
表2 LPS/D?GalN組和對(duì)照組肝組織中ATF4 mRNA的表達(dá)比較Tab.2 Comparison of ATF4 mRNA expression in LPS/D?GalN group and control group
2.4 抑制ATF4加劇了CCl4和LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷 為進(jìn)一步探討ATF4對(duì)肝臟損傷的影響,我們建立了ATF4靶向的CRISPR?Cas9質(zhì)粒(ATF4?cri),并經(jīng)尾靜脈注射達(dá)到下調(diào)ATF4在肝臟中的表達(dá)。如圖4A和B中所示,ATF4?cri質(zhì)粒有效地降低了肝臟ATF4的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。在注射ATF4?cri質(zhì)?;?qū)φ召|(zhì)粒后,使用CCl4或LPS/D?GalN處理小鼠。血清轉(zhuǎn)氨酶分析顯示,ATF4?cri抑制ATF4后,CCl4肝損傷模型中AST和ALT明顯升高(圖4B)。在LPS/D?GalN模型中獲得了相似的結(jié)果(圖4C)。這些數(shù)據(jù)提示ATF4的下調(diào)使小鼠對(duì)CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的肝損傷更加敏感,因而ATF4對(duì)肝損傷有重要保護(hù)作用,見表3、表4。
圖4 ATF4抑制促進(jìn)了CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的肝損傷Fig.4 Suppression of ATF4 promoted CCl4 and LPS/D?GalN induced liver injury
本研究揭示了小鼠體內(nèi)ATF4蛋白質(zhì)和mRNA水平表達(dá)模式的特征,首次報(bào)道在正常情況下小鼠肝臟中ATF4蛋白保持較高的水平。由于檢測(cè)的各組織中ATF4 mRNA水平無差異,故認(rèn)為在組織中ATF4蛋白的差異表達(dá)應(yīng)該是在翻譯水平或蛋白穩(wěn)定水平。眾所周知,ATF4蛋白通常在應(yīng)激條件下被上調(diào),并在應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。多種細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激途徑,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,氨基酸不足和氧化應(yīng)激都可以誘導(dǎo)eIF2α的磷酸化,這導(dǎo)致了蛋白質(zhì)合成的普遍抑制,而ATF4 mRNA翻譯反而上調(diào)[3]。本研究觀察到ATF4蛋白在小鼠肝臟中呈高水平,而在其他組織中卻幾乎檢測(cè)不到。然而在檢查的組織中eIF2α磷酸化水平均呈現(xiàn)一致的低水平,這與肝臟中ATF4蛋白的高水平不一致。故認(rèn)為肝臟ATF4蛋白高水平與eIF2α無關(guān)。為了證實(shí)這一推測(cè),我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素來觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和eIF2α磷酸化。衣霉素在小鼠肝臟和肺臟誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過剪接的XBP1 mRNA、Bip蛋白的增加和eIF2α磷酸化得到了證實(shí)。小鼠肺臟中被衣霉素持續(xù)誘導(dǎo)的ATF4蛋白提示肺臟中ATF4受到eIF2α的經(jīng)典調(diào)節(jié)。然而,在衣霉素處理后,肝臟中ATF4蛋白下降,這表明ATF4蛋白在肝組織中有一種與eIF2α無關(guān)的特殊調(diào)節(jié)模式。另一個(gè)可能的機(jī)制是ATF4的穩(wěn)定性在肝臟和其他組織中是不同的。據(jù)報(bào)道,ATF4的降解是由E3泛素連接SCFβTrCP介導(dǎo)的。另有報(bào)告表明,P300調(diào)節(jié)了ATF4的穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄活性。ATF4的穩(wěn)定性是否會(huì)導(dǎo)致組織中ATF4蛋白水平的差異需要進(jìn)一步的研究。
表3 ATF4對(duì)CCl4誘發(fā)的肝損傷(ALT,AST)的影響Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury(ALT,AST)induced by CCl4±s
表3 ATF4對(duì)CCl4誘發(fā)的肝損傷(ALT,AST)的影響Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury(ALT,AST)induced by CCl4±s
注:a表示與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;b表示與ATF4?cri對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;c表示與CCl4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;d表示與ATF4?cri+CCl4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
組別空白對(duì)照組ATF4?cri對(duì)照組CCl4組ATF4?cri+CCl4組F值P值A(chǔ)LT 53.2±11.8cd 91.2±58.0cd 2 602.3±1103.7abd 4 358.6±2192.0abc 17.469<0.001 AST 254.8±110.0cd 195.7±49.4cd 1 245.8±672.9abd 2 516.4±672.9abc 13.264<0.001
表4 ATF4對(duì)LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷(ALT,AST)的影響Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury(ALT,AST)induced by LPS/D?GalN ± s
表4 ATF4對(duì)LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷(ALT,AST)的影響Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury(ALT,AST)induced by LPS/D?GalN ± s
注:a表示與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;b表示與ATF4?cri對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;c表示與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;d表示與ATF4?cri+LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
組別空白對(duì)照組ATF4?cri對(duì)照組LPS組ATF4?cri+LPS 組F值P值A(chǔ)LT 102.7±22.32cd 124.83±14.6cd 2451.0±846.5abd 7777.8±3587.0abc 23.083<0.001 AST 57.7±21.8cd 71.3±20.9cd 3081.7±1193.3abd 13948.2±4160.7abc 55.699<0.001
本研究的目的是探索小鼠肝臟中ATF4蛋白表達(dá)的高水平是否暗示其在肝臟中的重要作用。據(jù)報(bào)道[17],ATF4突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的胎兒貧血和胎兒肝臟發(fā)育不全。另外有報(bào)道表明ATF4在肝臟脂質(zhì)代謝中起著重要的作用[8-11]。肝損傷是導(dǎo)致侵襲性肝臟疾病最常見的肝損害。本研究中,我們采用CCl4介導(dǎo)的慢性肝損傷模型和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型,探討了ATF4在肝損傷中的作用。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)在使用CCl4和LPS/D?GalN后,小鼠肝臟中的ATF4蛋白明顯降低,而mRNA無明顯變化?,F(xiàn)在的問題是,ATF4的降低在肝臟損傷中是否發(fā)揮了作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Crisper對(duì)ATF4的敲低作用明顯加重了CCl4和LPS/D?GalN所致的肝損傷,表現(xiàn)為血清AST和ALT進(jìn)一步升高。這些結(jié)果提示ATF4在肝損傷中具有保護(hù)作用。在以往的研究中,ATF4被認(rèn)為是正常細(xì)胞增殖的關(guān)鍵,尤其是對(duì)于胎肝造血時(shí)期所需的高水平增殖[17]。肝臟是一個(gè)再生能力極強(qiáng)的組織,肝細(xì)胞能夠在肝臟損傷反應(yīng)中增殖,以恢復(fù)其功能。在使用CCl4和LPS/D?GalN處理后的模型中,需要高水平的細(xì)胞增殖協(xié)助肝臟功能的恢復(fù)。因此,我們的結(jié)果的一個(gè)可能的解釋是ATF4的缺乏抑制了肝修復(fù)反應(yīng)中的細(xì)胞代償增殖,從而導(dǎo)致了更嚴(yán)重的肝損傷。ATF4的下調(diào)促進(jìn)肝損傷的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。
總之,本研究揭示了ATF4蛋白在小鼠肝臟中的表達(dá)不依賴于經(jīng)典調(diào)控模式。化學(xué)劑誘導(dǎo)的肝損傷可引起肝臟中ATF4蛋白的下調(diào),ATF4的下調(diào)促進(jìn)了CCl4和LPS/D?GalN誘導(dǎo)的肝損傷。