Wistar大鼠CBRH?3肝癌模型的構(gòu)建*

楊煒，冉立峰，周崑，朱輝，王智彪（.重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院/省部共建國家重點實驗室培育基地/重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室/重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室/重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶40006；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院HIFU腫瘤治療中心，重慶40006）

肝癌是致死率僅次于胃癌、食道癌的第三大惡性腫瘤。隨著現(xiàn)代醫(yī)療科技的發(fā)展，肝癌的治療也有了很大的進(jìn)展，且有多種治療方式，包括外科手術(shù)和非手術(shù)治療，非手術(shù)治療包括介入、射頻、微波、放療和高強度聚焦超聲（HIFU）[1-2]，這些治療方式各有優(yōu)勢和特點，但要治愈肝癌仍然是醫(yī)學(xué)界的難點。HIFU作為一種新型的無創(chuàng)治療手段，近年來發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于各種非空腔臟器實體良惡性腫瘤、肝癌、腹膜后腫瘤、乳腺腫瘤、子宮肌瘤的治療中。隨著該技術(shù)的發(fā)展，還適應(yīng)于多種非腫瘤良性疾病，能夠從體外無創(chuàng)地、適形地消融體內(nèi)的腫瘤。目前，HIFU已經(jīng)成為肝癌治療的重要手段之一[3-4]。但是HIFU治療肝癌的機制還有待進(jìn)一步研究。因此，為了研究HIFU治療肝癌的機制，以期能使HIFU更好地應(yīng)用于臨床，建立合適的肝癌模型就具有重要的臨床意義[5]。本文擬采用CBRH-3細(xì)胞株來構(gòu)建大鼠肝癌模型，取得了比較令人滿意的模型效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠：雄性30只，鼠齡10周，體重60 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供；裸鼠：雄性20只，體重20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 材料 CBRH-3（wistar大鼠肝癌細(xì)胞株，貼壁細(xì)胞），購于北京銀紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清由GIBCO公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)CBRH-3細(xì)胞株 將大鼠CBRH-3細(xì)胞株培養(yǎng)、擴增、傳代，從液氮罐里取出細(xì)胞凍存管，迅速放入38℃水浴中，并搖動，在1 min內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細(xì)胞，在1 000 r/min速度下離心5 min，棄上層液，加入適量培養(yǎng)液（含胎牛血清10%的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液），然后接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，第2天更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，若細(xì)胞密度達(dá)到90%時給予傳代。倒出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗1次，倒入0.25%的胰酶約1 mL。在顯微鏡下觀察，如果細(xì)胞變圓，則加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，巴氏管給予吹打使細(xì)胞脫落成細(xì)胞懸液，在1 000 r/min速度下離心5 min，棄去培養(yǎng)液，倒入新鮮的培養(yǎng)液，巴氏管吹打成細(xì)胞懸液，分入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，按1∶3傳代。

1.2.2 裸鼠皮下種植腫瘤細(xì)胞 將CBRH-3細(xì)胞株制成1×107mL-1的細(xì)胞懸液，注射入裸鼠背部兩側(cè)皮下，每側(cè)注射0.1 mL，2周后注射部位觀察長出直徑1～2 cm大小腫塊，用頸椎脫臼法處死裸鼠，無菌手術(shù)切下腫塊，放到生理鹽水中清洗，并把腫塊切成0.3～1.0 mm3組織大小的碎片備用。

1.2.3 Wistar大鼠肝癌模型的制備 用8%硫化鈉溶液將Wistar大鼠腹部脫毛，使其仰臥綁定于手術(shù)臺，用10%的水合氯醛按照0.3 mg/100 mg對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，在腹正中自劍突往下切開約1.5 cm創(chuàng)口，進(jìn)腹后暴露肝臟，在肉眼直視用小鑷子在肝臟上切一小口，長約5～10 mm，用紗布壓迫止血后取一瘤塊放入其內(nèi)，縫合切口。必要時用吸收性明膠海綿顆粒進(jìn)行填塞，如沒有發(fā)現(xiàn)活動性出血后關(guān)閉腹腔，為預(yù)防感染給予肌內(nèi)注射青霉素8萬U。將大鼠交回飼養(yǎng)中心繼續(xù)飼養(yǎng)，繼續(xù)觀察2周，術(shù)前1周及術(shù)后1周每天給每只大鼠注射地塞米松2 mg，大鼠的飲食、大小便及精神狀態(tài)無明顯變化。

2 結(jié) 果

2.1 磁共振成像（MRI）觀察腫瘤的生長情況 在裸鼠腹腔移植傳代CBRH-3細(xì)胞株接種后2周，除2只死亡外，58只中有51只在彩色多普勒超聲和MRI（GE 1.5T）上顯示直徑大小約1～2 cm的腫瘤（2只出現(xiàn)2個腫塊），彩色多普勒超聲提示大多數(shù)腫塊為高回聲，只有少數(shù)呈低回聲的表現(xiàn)；MRI檢測采用FSE序列T2WI和T1WI脂肪抑制序列，發(fā)現(xiàn)51只均在相應(yīng)部位出現(xiàn)圓形或類圓形腫塊影，T1WI呈均勻低信號、T2WI和T2WI脂肪抑制呈高信號，所有的腫塊均呈結(jié)節(jié)狀，信號均勻，邊界清楚，周圍未見明顯子灶，腫瘤無明顯纖維包裹、鈣化、凝固性壞死、出血、囊變和轉(zhuǎn)移征象。有部分大鼠伴有腹腔積液和腹膜后種植轉(zhuǎn)移灶。見圖1、2。

2.2 大體觀察及病理組織切片 腫瘤移植2周后，處死大鼠，肉眼觀察腫瘤組織生長、內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點及與周圍正常肝組織的情況；取出肝臟腫瘤，放入10%甲醛中固定，并進(jìn)行石蠟包埋切片以觀察腫瘤的組織病理學(xué)特征（圖3、4）。腫塊為魚肉狀灰白組織，無出血或者壞死改變，和周圍正常肝臟分界清楚，病理組織學(xué)：光學(xué)顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞呈巢狀或彌漫狀分布，胞核大濃染，異型性明顯，細(xì)胞大小不一，周邊伴行多支小血管，血供豐富，胞質(zhì)量少，為肝癌腫瘤。

圖1 裸鼠腫瘤

圖2 MRI檢查結(jié)果

圖3 Wistar大鼠肝移植瘤

圖4 Wistar大鼠腫瘤顯微鏡下（HE，200×）

3 討 論

原發(fā)性肝癌是典型的富血供腫瘤[6-7]，在中國是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。其病變進(jìn)展快，對患者危害大，病死率高，也是廣大科學(xué)工作者研究的重點。目前肝癌的治療方法主要為肝切除術(shù)和非手術(shù)治療。但肝癌的發(fā)病十分隱匿，臨床上僅有不到30%的患者就診時可獲得手術(shù)治療的機會，同時患者術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)率很高，患者腫瘤復(fù)發(fā)后的處理也相對較為困難，大部分患者只能接受非手術(shù)治療，應(yīng)用最廣泛的非手術(shù)治療方式是肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）[8-9]，其作用機制主要是用碘化油加化學(xué)藥物栓塞腫瘤供血血管，使其缺血缺氧而發(fā)生壞死，并能夠提高腫瘤局部化療藥濃度及作用時間，近期療效確切，經(jīng)過一段時間后栓塞劑會被清除，造成腫瘤復(fù)發(fā)，故其遠(yuǎn)期效果并不確切。HIFU是一種非侵入性治療，具有創(chuàng)傷小，無放、化療不良反應(yīng)，且可重復(fù)進(jìn)行的治療手段。目前，在肝癌治療領(lǐng)域已開始被接受用于無創(chuàng)治療，取得了較好的臨床效果。HIFU治療腫瘤的機制是高溫效應(yīng)和空化效應(yīng)，對于HIFU治療腫瘤尤其是肝癌的研究還需要大量的動物實驗和臨床試驗進(jìn)行相關(guān)的研究。因此必須快捷、高速、經(jīng)濟地建立一種合適的肝癌動物模型，以利于促進(jìn)HIFU治療肝癌的理論和實踐的發(fā)展。

近年來，大鼠肝癌模型分為3種，分別是誘發(fā)性模型[10]、自發(fā)性模型和移植性模型。誘發(fā)型常用二甲基亞硝胺（DENA）等化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)，建模周期較長，往往伴有肝硬化，腫瘤多為彌漫型或小結(jié)節(jié)型，無法滿足各種試驗性治療的需要和影像學(xué)診斷等方面的研究；自發(fā)性肝癌模型是動物自然發(fā)生的，未經(jīng)任何人工誘導(dǎo)。這類模型的缺點是培育及觀察時間較長、耗費較大、發(fā)生率較低，難以滿足研究的要求，目前已很少被采用。而移植性肝癌模型多呈結(jié)節(jié)腫塊型，邊緣較清晰，在影像診斷學(xué)方面和正常肝實質(zhì)易于分別，進(jìn)行各類實驗研究，便于模擬各種實驗?zāi)Ｐ汀Ｗ髡咴诟伟嶒炛械膭游锍＿x用可移植Walker-256癌肉瘤的Wistar大鼠[11-12]和移植VX2鱗癌的新西蘭大白兔[13-15]，Wistar大鼠移植性肝癌模型國內(nèi)研究較多，因其腫瘤血供與人類原發(fā)性肝癌相似，該模型的腫瘤血供特點為在瘤體直徑小于3 mm時主要由門靜脈供血，直徑大于3 mm時主要由肝動脈供血。研究表明，其血供特點和生長行為與人類肝癌極相似。兔VX2肝癌模型是少數(shù)建立在大動物體內(nèi)的肝臟富血供腫瘤模型，可以進(jìn)行Seldinger法操作，從而最大限度地模擬臨床經(jīng)TACE治療肝癌的操作過程，該模型也是供介入治療藥物代謝動力學(xué)研究較好的模型。但是這2種腫瘤模型的腫瘤細(xì)胞來源均不是肝癌細(xì)胞株，甲胎蛋白（AFP）陰性，故并不是真正意義上的肝細(xì)胞性肝癌模型。因此，本研究使用CBRH-3肝癌細(xì)胞株來構(gòu)建肝癌模型。大鼠肝癌細(xì)胞株來源于用DNA誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌，病理鑒定為肝細(xì)胞性肝癌，細(xì)胞具有其起源的體內(nèi)肝癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點，且可分泌AFP，體外培養(yǎng)觀察，細(xì)胞保持惡性類上皮細(xì)胞的形態(tài)特點，單層細(xì)胞培養(yǎng)可見細(xì)胞重疊堆積的生長現(xiàn)象，是很好的大鼠肝細(xì)胞癌瘤株，擬高效建立可以完全模擬臨床肝癌的動物模型，有利于對HIFU治療腫瘤的機制的深入研究。

作者通過對Wistar大鼠的CBRH-3肝癌模型的病理及影像學(xué)綜合分析，認(rèn)為該模型具有如下特點：（1）易于復(fù)制，移植成功率高，模型性能穩(wěn)定，死亡率低；（2）腫瘤生長方式與臨床肝細(xì)胞癌生長方式相似，呈膨脹浸潤性生長結(jié)節(jié)狀；（3）MRI表現(xiàn)與人體腫瘤相似，易于影像學(xué)診斷；（4）可快捷設(shè)計選擇腫瘤移植生長部位。

總之，Wistar大鼠的CBRH-3肝癌模型的生物學(xué)特性與人類原發(fā)性肝癌相似，該方法簡單安全，制作簡單，造模周期短，適用于HIFU治療肝臟腫瘤的效應(yīng)和機制的深入研究，為HIFU治療肝癌創(chuàng)造了良好的實驗基礎(chǔ)，值得推廣。