廣泛期小細胞肺癌胸部放療患者循環(huán)腫瘤細胞臨床價值的探索性研究△

張燁，惠周光，張文，馮林，張開泰，鄧壘，王文卿，周宗玫，王綠化#

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院1放療科，2特需醫(yī)療部，3免疫學研究室，4分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021

肺癌是目前病死率最高的常見惡性腫瘤，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的惡性程度高，占所有肺癌的10%～15%[1]。Govindan等[2]報道，廣泛期SCLC占SCLC的60%～70%，患者的中位生存期僅為12個月左右?；熓菑V泛期SCLC患者的首選治療方案，多個研究提示化療有效后行胸部放療可以明顯改善預后[3-5]，但該方案僅對部分患者有效[6]。而傳統(tǒng)的影像技術(shù)，如計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）難以早期判斷放化療的療效以及提示預后。因此，發(fā)現(xiàn)早期預測放化療后療效的分子標志物，指導廣泛期SCLC的個體化治療，是目前臨床亟待解決的問題。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是指在患者循環(huán)系統(tǒng)中存活并且能夠被檢測到的腫瘤細胞[7]。自1869年CTC在腫瘤患者中被首次發(fā)現(xiàn)以來，已有研究顯示CTC可以預測腫瘤患者的療效并提示預后[8]。然而，CTC在SCLC中的研究主要集中在化療前后的CTC數(shù)目與SCLC的療效及化療敏感性的關(guān)聯(lián)性上[9-18]。有關(guān)CTC在化療有效患者接受胸部放療后療效預測和預后評價中的作用尚未有報道。而且，既往報道中采用檢測CTC的CellSearch技術(shù)僅能檢測上皮樣細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）陽性的CTC，對于EpCAM陰性的CTC無法檢測。本研究組前期采用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的oHSV1-hTERT-GFP技術(shù)檢測CTC，該技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、可分離觀察CTC形態(tài)等優(yōu)點。因此，本研究擬采用該技術(shù)檢測化療后有效的廣泛期SCLC患者接受胸部放療前后的CTC數(shù)目，初步探討CTC與胸部放療后患者預后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年11月至2015年7月在中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院接受胸部放療的廣泛期SCLC患者。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為SCLC；②經(jīng)頸胸腹CT、腦MRI、骨掃描等全面檢查，根據(jù)美國退伍軍人醫(yī)院的SCLC分期為廣泛期；③KPS評分＞70分，年齡＞18歲；④初治SCLC患者，行全身化療方案評價有效；⑤愿意接受胸部放療；⑥對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①繼發(fā)或轉(zhuǎn)移SCLC患者；②合并第二原發(fā)腫瘤者；③胸部放療未實施或者治療未完成；④隨訪資料不完整。

1.2 治療方案以及療效評價

所有患者均接受4個周期以上的全身化療，化療方案為以順鉑為基礎(chǔ)的一線方案，化療中予以止吐、水化等對癥支持處理。每2個周期化療后，均對患者進行化療療效評價，包括頸胸腹CT和腦MRI。根據(jù)RECIST 1.1標準進行療效評價，有效定義為完全緩解（CR）和部分緩解（PR）。疾病進展定義為患者出現(xiàn)局部區(qū)域或者遠處進展、死亡或者失訪。所有治療有效的患者均接受胸部放療，放療靶區(qū)大體腫瘤體積包括殘留的肺部原發(fā)病灶以及殘留的縱隔和鎖骨上腫大淋巴結(jié)。臨床腫瘤體積（clinical tumor volume，CTV）為原發(fā)病灶外放8 mm，以及化療前受累的縱隔和鎖骨上淋巴引流區(qū)，CTV外放5 mm為計劃靶區(qū)體積（planning target volume，PTV）。處方劑量為95%PTV 60 Gy，每次2 Gy，共30次，或45 Gy，每次3 Gy，共15次。所有放療計劃均采用調(diào)強放射治療技術(shù)。胸部放療后休息1個月評價有效的患者在排除腦轉(zhuǎn)移后予以腦預防照射，照射靶區(qū)為全腦，處方劑量為25 Gy，每次2.5 Gy，共10次，照射技術(shù)為二維兩野對穿照射。所有患者治療結(jié)束后均定期隨訪，第1～2年每3個月復查1次，第3～5年每6個月復查1次，隨訪日期截至2018年1月，隨訪內(nèi)容包括頸胸腹CT和腦MRI。生化檢驗結(jié)果顯示堿性磷酸酶升高，或全身有明顯的疼痛、固定壓痛點時，行骨掃描檢查?？偵鏁r間（overall survival，OS）定義為從病理診斷開始日期到患者死亡、失訪日期或者末次隨訪日期。

1.3 CTC檢測

所有入組患者在胸部放療前、后共2個時間點，分別抽取空腹靜脈血4 ml至EDTA抗凝采血管（購自美國BD公司）中，并于標本離體后1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室用于CTC檢測。重要實驗步驟如下[19-20]：①抗凝血經(jīng)紅細胞裂解液（購自美國Qiagen公司）裂解紅細胞，分離有核細胞；2 ml RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國HyClone公司）重懸有核細胞，移入6孔板并標記，每孔加入1 ml單細胞懸液（4 ml血約含有1×107個有核細胞）。取出oHSV1-hTERT-GFP病毒，將病毒加入上述加有細胞懸液的6孔板中（按照MOI=1比例感染細胞）。將6孔板放入37℃、5%CO2條件下的孵箱內(nèi)孵育1 h后取出，每孔補加1 ml含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放置在原孵箱內(nèi)進行孵育。轉(zhuǎn)染病毒20～24 h后收集細胞（病毒pfu約為1.3×108，因此每孔加入病毒50 μl）。②收集細胞，并用CD45單克隆抗體（HI30）-PECy5（購自美國BD公司）標記白細胞，陰選血液中的CTC：向上述細胞中加入400 μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），100 μl CD45抗體（100 μl反應體系中20 μl CD45抗體與 1×106個細胞充分反應，每支離心管中約5×106個細胞），室溫下避光孵育30 min。孵育30 min后每支離心管中加入2 ml PBS洗滌，500×g離心5 min后棄掉PBS。③Guava系列流式細胞儀（購自美國Millipore公司）檢測CTC：將上述的單細胞懸液加入到96孔板中，每孔200 μl，細胞流式儀檢測結(jié)束后記錄并分析整理數(shù)據(jù)（CD45-/GFP+的細胞定義為CTC）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以率（%）表示。采用多因素線性回歸分析CTC數(shù)目與臨床特征的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，兩組生存時間的比較采用Logrank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征及治療情況

本研究共入組16例一線化療有效的廣泛期SCLC患者，其中1例患者胸部放療后出院失訪，最終15例患者納入分析。15例廣泛期SCLC患者的年齡為42～68歲，中位年齡59歲；吸煙數(shù)量0～120包/年，中位吸煙數(shù)量30包/年；化療周期4～8個，中位化療周期6個；其他臨床特征和治療情況詳見表1。

表1 15例廣泛期SCLC患者的臨床特征和治療情況

2.2 預后

至隨訪結(jié)束，共對患者進行了6.0～42.2個月的隨訪，中位隨訪時間35.5個月，其中生存患者的隨訪時間為34.5～42.2個月，中位隨訪時間39.4個月。共9例患者治療失敗，隨訪過程中出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。15例SCLC患者的OS為6.0～42.2個月，中位OS為35.5個月；無疾病進展生存時間（progression-free survival，PFS）為4.6～42.2個月，中位PFS為29.8個月。

2.3 胸部放療前后CTC的數(shù)目

15例廣泛期SCLC患者均檢測到CTC，CTC檢出率為100%。胸部放療前基線水平的CTC中位數(shù)目為27/4 ml[（6～50）/4 ml]；胸部放療后的CTC中位數(shù)目為11/4 ml[（1～23）/4 ml]。多因素線性回歸分析顯示：胸部放療前CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者的年齡、性別、吸煙、TNM分期、是否單臟器轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目均無關(guān)（P＞0.05）。

2.4 胸部放療前CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者PFS和OS的關(guān)系

以胸部放療前基線水平的CTC中位數(shù)目27/4 ml為界，將全組患者分為CTC≥27/4 ml組（高基線組）和CTC＜27/4 ml組（低基線組）。高基線組患者共8例，其中6例患者復發(fā)。低基線組患者共7例，其中3例患者復發(fā)。高基線組的中位PFS為9.5個月，低基線組的中位PFS時間未達到，但兩組患者的中位PFS比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.64，P=0.20）。高基線組4例患者死亡，低基線組2例患者死亡。高基線組的中位OS為14.2個月，低基線組的中位OS未達到，但兩組患者的中位OS比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.45，P=0.22）。散點圖提示隨著胸部放療前CTC數(shù)目的增加，無疾病進展生存及總生存時間逐漸縮短。（圖1～圖4）

圖1 胸部放療前不同基線CTC數(shù)目患者的PFS

圖2 胸部放療前CTC數(shù)目與PFS的散點圖

2.5 胸部放療后CTC數(shù)目與廣泛期SCLC患者PFS和OS的關(guān)系

以胸部放療后的CTC中位數(shù)目11/4 ml為界，將全組患者分為CTC≥11/4 ml組（高療后組）和CTC＜11/4 ml組（低療后組）。高療后組患者共6例，全部復發(fā)。其中5例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，另1例患者胸部放療前CTC數(shù)目為6/4 ml，胸部放療后上升至17/4 ml，該患者很快出現(xiàn)復發(fā)。低療后組患者共9例，3例患者復發(fā)，6例患者未復發(fā)。未復發(fā)患者中，2例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，胸部放療后下降至（2～3）/ml。3例復發(fā)患者中，1例患者胸部放療前CTC數(shù)目超過27/4 ml，3例患者的復發(fā)時間均較晚。高療后組的中位PFS為6.1個月，低療后組的中位PFS未達到，兩組患者的中位PFS比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.25，P＜0.01）。高療后組死亡5例，低療后組死亡1例。高療后組的中位OS為12.2個月，低療后組的中位OS未達到，兩組患者的中位OS比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.85，P＜0.01）。散點圖提示隨著胸部放療后CTC數(shù)目的增加，無疾病進展生存以及總生存時間逐漸縮短。（圖5～圖8）

圖3 胸部放療前不同基線CTC數(shù)目患者的OS

圖4 胸部放療前CTC數(shù)目與OS的散點圖

圖5 胸部放療后不同CTC數(shù)目患者的PFS

圖6 胸部放療后CTC數(shù)目與PFS的散點圖

圖7 胸部放療后不同CTC數(shù)目患者的OS

圖8 胸部放療后CTC數(shù)目與OS的散點圖

3 討論

本研究首次報道了胸部放療前后CTC與廣泛期SCLC化療有效患者的療效預測和預后關(guān)系。初步研究結(jié)果顯示，接受胸部放療的一線化療有效的廣泛期SCLC患者，放療后的CTC數(shù)目與其胸部放療的療效以及預后明顯有關(guān)。低療后組患者治療失敗的例數(shù)遠小于高療后組，而且低療后組患者的PFS和OS均明顯長于高療后組（P＜0.01）。胸部放療前低基線組患者復發(fā)和死亡的例數(shù)也均低于高基線組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

端粒酶在人體正常細胞中的活性往往被抑制，而在90%以上的腫瘤細胞中處于活化狀態(tài)[21]，腫瘤細胞中端粒酶的轉(zhuǎn)錄水平較高。本研究檢測方法的建立便以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建了插入人端粒酶活性催化單位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動子和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達的單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV），將HSV病毒的復制關(guān)鍵基因ICP4的啟動子替換為hTERT啟動子，并在下游連接GFP表達盒。HSV病毒在感染腫瘤細胞后，在hTERT高表達的細胞內(nèi)環(huán)境中激活hTERT啟動子下游的GFP表達，從而使腫瘤細胞能夠自發(fā)綠色熒光，隨后即可通過流式細胞儀直接對CTC進行計數(shù)。該技術(shù)已用于多種惡性腫瘤的CTC檢測[19]。與Cell-Search技術(shù)相比，該技術(shù)對肺癌CTC的檢出率較高（33.3%vs 71.2%，P＜0.01），而且檢出率不受肺癌病理類型和分期的影響[22]。本研究利用該技術(shù)對廣泛期SCLC患者CTC的檢出率為100%，高于Cell-Search技術(shù)的89.5%～100%[9,11-12,14,16-18]，以及RT-PCR技術(shù)的84.4%～96.4%[10,15]，也再次證實本技術(shù)的高敏感度。近期，有研究報道采用類似的腺病毒技術(shù)（OBP-401）用于檢測CTC，檢出率為96%，然而該技術(shù)有明顯的缺陷，僅能檢測具有一定大小的GFP陽性表達的CTC[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，胸部放療前基線水平CTC數(shù)目≥27/4 ml組的患者中位PFS為9.5個月，中位OS為14.2個月，而且隨著CTC數(shù)目增加，疾病控制越差，同時患者的生存情況也越差。既往多個研究均提示，對于SCLC患者，一線化療前的基線CTC數(shù)目與腫瘤的復發(fā)和生存相關(guān)[9-11,13,15-18]。Aggarwal等[9]采用CellSearch技術(shù)檢測50例SCLC患者的CTC數(shù)目，其中廣泛期SCLC患者30例，研究發(fā)現(xiàn)基線CTC數(shù)目＜50個患者的中位PFS明顯長于CTC≥50個患者（10個月 vs 4.8個月，P＜0.01），而且兩組患者的OS比較，差異也有統(tǒng)計學意義（20.2個月 vs 11.8個月，P＜0.05）。同樣的，Cheng等[11]報道了89例廣泛期SCLC患者，治療前CTC數(shù)目＜10個患者與CTC數(shù)目≥10個患者的OS比較，差異有統(tǒng)計學意義（16.6個月 vs 8.2個月，P＜0.01），但兩組患者的PFS比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。另外，有2個研究報道采用RT-PCR技術(shù)分別檢測葉酸受體陽性和CK-19 mRNA陽性CTC也得到類似的結(jié)果[10,15]。其中Shen等[10]利用RT-PCR檢測葉酸受體陽性CTC技術(shù)檢測80例SCLC患者，其中廣泛期SCLC患者77例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一線化療前基線低水平CTC患者的中位PFS長于基線高水平CTC患者（9.1個月vs 6.9個月，P＜0.05）。與本研究采用類似病毒技術(shù)的Huang等[12]對25例廣泛期SCLC患者進行研究，發(fā)現(xiàn)基線CTC數(shù)目≥5個患者的OS短于CTC數(shù)目＜5個的患者（358 d vs 223 d），但受樣本量的限制，兩組患者的OS比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究也得到同樣的結(jié)果，基線水平的CTC可能提示廣泛期SCLC患者的復發(fā)和生存。對于大部分基線水平CTC數(shù)目較高的患者，行胸部放療后很快出現(xiàn)全身進展，這些患者是否需要加強全身治療而非行胸部放療，值得進一步的研究。

本研究中胸部放療后CTC數(shù)目≥11/4 ml的患者PFS和OS均明顯短于CTC數(shù)目＜11/4 ml的患者（P＜0.01），而且CTC數(shù)目越多，復發(fā)的風險越大，出現(xiàn)復發(fā)的時間越短。既往也有多個研究證實，對于SCLC患者，采用CellSearch和RT-PCR技術(shù)檢測一線化療后的CTC數(shù)目與腫瘤的復發(fā)和生存有關(guān)[9,11,15,17-18]。Aggarwal等[9]利用 CellSearch 檢測技術(shù)對CTC進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2個周期化療第1天CTC數(shù)目＜5個患者的中位PFS遠高于CTC數(shù)目≥5個的患者（10個月 vs 3.17個月，P＜0.01），兩組患者的OS比較，差異有統(tǒng)計學意義（18個月vs 9個月，P＜0.01）。同樣的，Cheng等[11]報道中，第2個周期化療后的CTC數(shù)目＜10個提示預后良好，CTC數(shù)目≥10個和＜10個兩組患者的中位PFS和中位OS比較，差異均有統(tǒng)計學意義（5.6個月 vs 3.1個月，P＜0.01；12.7個月vs 6.9個月，P＜0.01）。Shi等[15]采用RT-PCR技術(shù)檢測CK-19 mRNA陽性CTC時也發(fā)現(xiàn)，1個周期化療后和3個周期化療后能檢測到CTC的患者，其PFS和OS均短于無法檢測到CTC的患者（P=0.008和P=0.002；P=0.003和P=0.001）。與本研究采用類似病毒技術(shù)的研究也發(fā)現(xiàn)，2個周期化療后PR的患者，CTC數(shù)目＜2個提示良好的PFS（8.3個月 vs 3.8個月，P=0.07），受病例數(shù)限制，兩組患者的PFS比較，差異無統(tǒng)計學意義[12]。以上研究均進一步證實胸部放療后CTC數(shù)目可提示廣泛期SCLC的復發(fā)和生存。胸部放療后CTC數(shù)目高的患者，包括胸部放療前CTC數(shù)目低但胸部放療后CTC數(shù)目升高的患者，均很快出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，對于該類患者，需要加強全身治療才可能改善療效。但也需要注意胸部放療前CTC數(shù)目高，而經(jīng)胸部放療后迅速下降的患者，預后和疾病控制好，值得進一步驗證。

本研究還存在一定的不足：①全組研究病例數(shù)少，盡管廣泛期SCLC一線化療后有效率高，但化療后接受胸部放療的患者相對少，入組偏慢。②本研究中納入的廣泛期SCLC患者的中位PFS和中位OS要明顯長于既往的研究報道，可能與本研究中納入的患者高選擇性有關(guān)，如胸部放療前的腫瘤負荷小，單臟器轉(zhuǎn)移多以及轉(zhuǎn)移數(shù)目相對較少，而且均是化療后轉(zhuǎn)移病灶消失、胸部病灶明顯縮小的患者。③本研究未在患者隨訪階段監(jiān)測CTC數(shù)目，無法詳細反映腫瘤的負荷動態(tài)變化與CTC數(shù)目的關(guān)系。

綜上所述，本研究初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于一線化療有效的廣泛期SCLC患者，胸部放療后的CTC數(shù)目可以預測患者的復發(fā)以及生存，但需要進一步擴大樣本量進行驗證。

利益沖突和作者貢獻聲明

本研究所有作者均無潛在利益沖突。張燁負責研究設(shè)計、病例收集、數(shù)據(jù)分析和論文寫作；惠周光負責數(shù)據(jù)分析和論文寫作；張文、馮林、張開泰負責循環(huán)腫瘤細胞的檢測；鄧壘、王文卿、周宗玫負責病例收集、標本質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析；王綠化負責研究設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和論文寫作。