miRNA-143對宮頸癌細胞增殖及凋亡的影響及機制研究

王利君，王武亮，袁博，王晨陽

鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州450014

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在中國均呈上升趨勢，其發(fā)生及發(fā)展是一個多階段、多基因的過程，研究宮頸癌的發(fā)病原因及機制對其診斷和治療具有重要意義[1]。微RNA（miRNA）是一類由19～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，已有大量研究顯示其在細胞增殖、凋亡、分化及腫瘤的發(fā)病機制中有重要的調(diào)控作用，且一些研究顯示miRNA在腫瘤、糖尿病、心血管疾病中發(fā)揮重要作用[2-3]。miRNA-143是miRNA家族中的一員，其表達具有腫瘤特異性，在肺癌、前列腺癌中低表達[4]，而在肝癌中高表達[5]。缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在腫瘤組織中表達廣泛，HIF-1α在腫瘤細胞的增殖和遷移及腫瘤血管生成等過程中發(fā)揮重要作用[6]，且通過靶基因預測軟件預測到miRNA-143與HIF-1α存在靶向關系，但miRNA-143靶向HIF-1α對宮頸癌細胞生物學特性的影響及機制尚不清楚。本研究探討了miRNA-143與HIF-1α的靶向關系，并研究了影響宮頸癌細胞增殖及凋亡的機制，以期為宮頸癌的診斷及治療提供理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2015年2月至2016年6月于鄭州大學第二附屬醫(yī)院存檔的50例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應的癌旁組織標本。50例患者中，年齡32～82歲，平均（50.4±9.2）歲。所有患者術前均未行放化療及其他治療，且有完整的臨床資料。人宮頸癌C-33A、HeLa、CaSki細胞均購自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、胰酶、青霉素、鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Abcam公司；RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；CCK8試劑盒、BCA試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司；酶標儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌C-33A、HeLa、CaSki細胞，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的混合液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達到80%以上時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，根據(jù)實驗需要進行傳代培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后即可用于實驗。

1.4 不同組織及細胞中miRNA-143表達水平的檢測

采用RNA提取試劑盒提取宮頸癌組織、癌旁組織及不同宮頸癌細胞中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Oligo 6.0軟件設計目的基因miRNA-143及內(nèi)參基因U6的引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照試劑盒說明書設置反應體系及參數(shù)，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miRNA-143的表達水平。實驗重復3次。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

取生長至對數(shù)期的人宮頸癌HeLa細胞，參考Invitrogen公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法分別將miRNA-143 mimics、miRNA-143 inhibitor及HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中（3個實驗組），未轉(zhuǎn)染的作為對照組，調(diào)整各組細胞濃度為5×104/ml，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達到30%～50%時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后室溫放置20 min，6 h后換成RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Western blot檢測miRNA-143 mimics組、miRNA-143 inhibitor組和對照組細胞中HIF-1α蛋白的表達水平，實驗重復3次。

1.6 熒光素酶活性檢測

miRBase（http://mirbase.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、PicTa（http://pictar.mdc-berlin.de/）三大靶基因預測庫預測到miRNA-143與HIF-1α的3′-UTR存在結合位點。為了驗證miRNA-143與HIF-1α是否存在靶向關系，構建野生型HIF-1α（Wt-HIF-1α）和突變型HIF-1α（Mut-HIF-1α）的3′-UTR熒光素酶報告載體，并進行miRNA-NC+miRNA-143 mimics、Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics、Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics三組共轉(zhuǎn)染，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明檢測各組細胞中雙熒光素酶的活性。實驗重復3次。

1.7 細胞增殖檢測

取對照組、miRNA-143 mimics組及 HIF-1α-siRNA組細胞。采用0.25%的胰蛋白酶消化上述3組細胞，調(diào)整細胞濃度為 5×103/ml，取 200 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，設置6個復孔，48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標儀在490 nm波長處測定并記錄各組的吸光度A，計算細胞存活率。細胞存活率=（轉(zhuǎn)染組細胞A值/對照組細胞A值）×100%。實驗重復3次。

1.8 細胞凋亡檢測

采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡。對照組、miRNA-143 mimics組、HIF-1α-siRNA組細胞生長至融合度達80%左右時收集細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，離心，棄上清，取1×106個細胞加入100 μl結合緩沖液懸浮細胞，取懸浮液再加入PI和Annexin V-FITC各5 μl，充分混勻后室溫避光靜置20 min，再加入400 μl結合緩沖液，上機，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.9 Ki-67、cleaved caspase 3、 β-catenin、cyclin D 1蛋白表達檢測

收集培養(yǎng)48 h的對照組、miRNA-143 mimics組、HIF-1α-siRNA組細胞，提取細胞中的蛋白，采用BCA試劑盒對蛋白進行定量，配置12%的分離膠及5%的濃縮膠，將蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶1的比例混勻，取變性蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離后4℃轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上，采用50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1、GAPDH，1∶500稀釋），4℃孵育過夜，然后加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋），ECL發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析 Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-143在宮頸癌組織及細胞中的表達

RT-PCR檢測結果顯示，宮頸癌組織中miRNA-143的表達水平為（0.892±0.107），明顯低于癌旁組織的（6.248±0.735），差異有統(tǒng)計學意義（t=60.29，P＜0.01）。人宮頸癌CaSki細胞中的miRNA-143表達水平高于人宮頸癌HeLa細胞和C-33A細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 不同宮頸癌細胞中miRNA-143表達水平的比較（±s）

表1 不同宮頸癌細胞中miRNA-143表達水平的比較（±s）

注：*與CaSki細胞比較，P＜0.05

2.2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達水平的比較

miRNA-143 mimics組的HIF-1α蛋白表達水平低于對照組，miRNA-143 inhibitor組的HIF-1α蛋白表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表 2）

表2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達水平的比較（±s）

表2 不同組別HIF- 1 α蛋白表達水平的比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

2.3 不同組別熒光素酶活性的比較

Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics組的熒光素酶活性低于miRNA-NC+miRNA-143 mimics組和Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics組與miRNA-NC+miRNA-143 mimics組的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同組別熒光素酶活性的比較（±s）

注：*與Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics組比較，P＜0.05

2.4 不同組別HeLa細胞存活率的比較

miRNA-143 mimics組和HIF-1α-siRNA組的細胞存活率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表 4）

表4 不同組別HeLa細胞存活率的比較（%±s）

表4 不同組別HeLa細胞存活率的比較（%±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

2.5 不同組別HeLa細胞凋亡率的比較

miRNA-143 mimics組和HIF-1α-siRNA組的細胞凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖1、表5）

2.6 不同組別Ki-67、cleaved caspase 3、 βcatenin、cyclin D 1蛋白表達水平的比較

miRNA-143 mimics組和 HIF-1α-siRNA組的Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白表達水平均低于對照組，cleaved caspase 3蛋白表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2、表6）

3 討論

近些年，miRNA作為重要的基因調(diào)控分子，與腫瘤的關系已成為生物學領域的研究熱點。作為調(diào)控基因表達網(wǎng)絡的重要部分，miRNA可參與調(diào)控多條信號通路[7]。研究顯示，miRNA參與細胞增殖、凋亡、早期發(fā)育、脂肪代謝等一系列生命活動的各個進程，在胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)異常表達，發(fā)揮原癌基因或抑癌基因的作用，其表達上調(diào)可通過下調(diào)抑癌基因而發(fā)揮癌基因的作用，表達下調(diào)可通過上調(diào)原癌基因而發(fā)揮抑癌基因的作用[8-9]。miRNA-143的生物學功能十分廣泛，參與牙齒發(fā)育、卵泡發(fā)育、脂肪代謝等生命活動的各個進程，在不同腫瘤中的表達可能不同，在乳腺癌、胃癌、直腸癌中表達下調(diào)，在肝癌中表達上調(diào)[10-12]。本研究結果顯示，miRNA-143在宮頸癌組織中低表達，說明miRNA-143低表達影響了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。

圖1 過表達miRNA-143和干擾HIF- 1α 對HeLa細胞凋亡的影響

表5 不同組別HeLa細胞凋亡率的比較（%±s）

表5 不同組別HeLa細胞凋亡率的比較（%±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

miRNA調(diào)控疾病的機制可能與其調(diào)控的靶基因有關，靶基因預測軟件顯示HIF-1α是miRNA-143的一個靶基因。HIF-1α是近些年發(fā)現(xiàn)的在人體缺氧條件下存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達，影響腫瘤的生長、凋亡、侵襲等過程[13-14]。有研究顯示，miRNA-143可靶向HIF-1α，抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡[15]。為證實miRNA-143靶向HIF-1α對宮頸癌細胞增殖及凋亡的影響，本研究首先證實HIF-1α是miRNA-143的靶基因，細胞增殖及凋亡結果顯示，上調(diào)miRNA-143及抑制HIF-1α的表達均可抑制宮頸癌細胞增殖并促進其凋亡。

圖2 過表達miRNA-143和干擾HIF- 1α 對Ki-67、cleaved caspase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達的影響

表6 不同組別Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達水平的比較（±s）

表6 不同組別Ki-67、cleavedcas pase 3、β -catenin、cyclin D 1蛋白表達水平的比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

細胞增殖及凋亡平衡是維持機體正常生長發(fā)育所必須的，Ki-67和caspase 3是與細胞增殖和凋亡密切相關的關鍵基因。Ki-67位于人染色體10q25，是一種與細胞增殖相關的基因，在腫瘤增殖各時期均有表達，參與多種腫瘤細胞的生長、發(fā)展及侵襲等過程，目前已作為檢測腫瘤的標志物[16]。caspase 3是Caspase家族的關鍵蛋白，位于caspase級聯(lián)反應的下游，在受到凋亡信號刺激后被激活，激活后的caspase 3參與胃癌、肺癌等多種腫瘤細胞的凋亡[17-18]。Wnt信號通路是一條在進化上相對保守的信號途徑，參與細胞增殖、分化、個體發(fā)育、凋亡等過程，Wnt/β-catenin是一條經(jīng)典的Wnt信號通路，與腫瘤發(fā)生、衰老和退化、骨質(zhì)疏松等疾病有關，其激活可導致宮頸癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生，也有研究顯示阻斷該信號通路可抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[19-21]。本研究結果顯示，上調(diào)miRNA-143的表達及抑制HIF-1α的表達后，可使Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白的表達水平降低，cleaved caspase 3蛋白的表達水平升高。

綜上所述，miRNA-143可通過靶向HIF-1α抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡，可為宮頸癌的診斷及治療提供新的策略及靶點。