益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞代謝記憶的影響

章文星 杜月光 柴可夫

作者單位：浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）最常見的并發(fā)癥之一。研究[1-2]顯示，糖脂代謝紊亂在DN發(fā)病過程中起著重要作用，同時(shí)長期的代謝紊亂通過改變表觀遺傳修飾，激活持續(xù)的炎癥反應(yīng)，形成代謝記憶，從而造成血管損傷，引起血管并發(fā)癥。而代謝記憶可能與DM患者瘀血的形成有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病屬“消渴”范疇，主要病變臟腑在肺、胃、腎，其中腎臟最為關(guān)鍵，尤其多見腎陰不足。隨著病情的發(fā)展，久病入絡(luò)，瘀血阻滯，臨床中久病的消渴患者常有肢體麻木，靜脈曲張，甚至中風(fēng)偏癱等血脈瘀滯表現(xiàn)。益氣養(yǎng)陰活血方是根據(jù)臨床消渴患者常氣陰不足兼瘀血阻滯的病機(jī)而形成的一張經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、女貞子、葛根、丹參、制大黃等組成，臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，該方治療早期糖尿病腎病效果較好。本實(shí)驗(yàn)通過腎小管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方式，從轉(zhuǎn)錄共激活因子P300（P300）、沉默調(diào)節(jié)因子 1（SIRT1）的 mRNA 表達(dá)水平，探討益氣養(yǎng)陰活血方干預(yù)及預(yù)防代謝記憶的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要試劑和儀器 1g/L DMEM培養(yǎng)基，批號(hào)C11885500BT；胎牛血清（GIBCO），批號(hào) 1715752；scriptTMgDNAClear cDNASynthesis Kit試劑盒（BIORAD），批號(hào) 1725035；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（碧云天），批號(hào) 030917170511；α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（Abcam），批號(hào) ab21027；E-鈣黏蛋白（ECadherin）抗體（Abcam），批號(hào) ab76055；益氣養(yǎng)陰活血方（黃芪、靈芝、女貞子、葛根、丹參、制大黃）（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部提供）。

1.2 益氣養(yǎng)陰活血方含藥血清制備 8周齡，體質(zhì)量250～300g的純種雄性SD大鼠20只（浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184，在SPF狀態(tài)下普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層將大鼠隨機(jī)分成含藥血清組10只，正常對(duì)照組10只。含藥血清組予益氣養(yǎng)陰活血方（組成：黃芪20g，靈芝、女貞子各 10g，葛根、丹參各 20g，制大黃5g，共計(jì)85g生藥。加5倍量水浸泡2h，煎煮1h，過濾藥液，濾渣另加3倍量水煎煮1h，過濾藥液，二次水煎劑混合后，濃縮成0.8g/mL）水煎劑灌服。通過體表面積換算大鼠每日灌藥劑量為0.85mL/100g（6.8g生藥/kg），每天9:00及15:00各灌胃1次，連續(xù)3天。正常對(duì)照組予生理鹽水灌服。末次灌胃1h后處死大鼠，收集血清，-20℃凍存待用。

1.3 大鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng) 正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E細(xì)胞）[中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫（SIBS）]。NRK-52E細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清1g/L葡萄糖濃度DMEM培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀察貼壁融合率達(dá)80%～90%時(shí)，以胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸浮液進(jìn)行傳代、培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè) 在96孔培養(yǎng)板中每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，含10%胎牛血清1g/L DMEM培養(yǎng)基37℃溫育箱培養(yǎng)，顯微鏡下觀察完全貼壁后開始實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)。每組設(shè)置6個(gè)副孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的 30、35、40、50、60、70mmol/L 的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)終止后，去除原溶液，按組每孔加入100μL，葡萄糖低糖組加入含1g/L濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液10μL，37℃溫育箱避光孵育4h。凋零孔組不加細(xì)胞培養(yǎng)，處理同低糖組。終止后每孔加入100μL Formanzan溶液，37℃溫育箱避光繼續(xù)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm測(cè)定吸光度，計(jì)算出抑制率，抑制率=（低糖組平均OD值-高糖組平均OD值/低糖組平均OD值-凋零孔OD值）×100%。抑制率最高且值≥50%為最佳制備高糖細(xì)胞模型濃度。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，選取適宜的制備模型的高糖濃度，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)分組：低糖組予64h低糖，高糖組予64h高糖，短暫高糖組予16h高糖+48h低糖，高糖+中藥血清治療組予16h高糖+48h含中藥血清高糖，短暫高糖+中藥血清治療組予16h高糖+48h含中藥血清低糖。低糖組葡萄糖濃度為1g/L。各組均加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.3 免疫組化法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞α-SMA和ECadherin表達(dá) 將無菌的小圓片置于6孔板中，每組3個(gè)副孔，計(jì)數(shù)后每孔接種1.6×105個(gè)細(xì)胞，加常規(guī)培養(yǎng)基37℃溫育箱培養(yǎng)24h，然后按2.2的方法置于37℃溫育箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)終止后，PBS清洗，福爾馬林固定，按試劑盒說明書加入一抗稀釋液，4℃冰箱過夜。PBS清洗，加入二抗稀釋液，進(jìn)行DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素染色，脫水，透明，封片。檢測(cè)α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)P300、SIRT1 mRNA表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)同上。Trizol法提取RNA。測(cè)量OD 260/280值，值在1.8～2.0符合要求。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列，見表1。

表1 PCR引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料采用方差分析，組間比較采用SNK檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組MTT OD值及抑制率結(jié)果比較 高糖濃

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性階段溫度及時(shí)間：50℃ 2min，95℃ 10min；擴(kuò)增階段溫度及時(shí)間：95℃15s，60℃ 60s，95℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)；后延伸階段溫度及時(shí)間：95℃ 30s，60℃ 15s。采用 2-Δct表示基因相對(duì)水平。度為60mmol/L時(shí)抑制率最高，是最佳制備高糖模型的濃度。見圖1（封三）。

3.2 各組NRK-52E細(xì)胞α-SMA、E-Cadherin表達(dá)情況比較 高糖刺激后，NRK-52E細(xì)胞α-SMA表達(dá)顯著升高，E-Cadherin隨著高糖刺激時(shí)間增加表達(dá)逐漸降低。高糖刺激16h后改為低糖培養(yǎng)，α-SMA表達(dá)較正常組仍有明顯升高，E-Cadherin表達(dá)較正常組略微減少。中藥血清干預(yù)后，α-SMA表達(dá)減弱，高糖刺激時(shí)間越短，干預(yù)效果越明顯，中藥血清干預(yù)后E-Cadherin表達(dá)明顯增加。見圖2、3（封三）。

圖1 各組MTT OD值及抑制率結(jié)果比較

圖2 各組NRK-52E細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況比較（Envision染色 ×200）

圖3 各組NRK-52E細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)情況比較（Envision染色 ×200）

圖4 各組P300、SIRT1 mRNA表達(dá)比較

3.3 各組P300、SIRT1 mRNA表達(dá)比較 高糖刺激導(dǎo)致SIRT1 mRNA表達(dá)相對(duì)降低，P300 mRNA表達(dá)相對(duì)增加，與低糖組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高糖組與短暫高糖組比較，SIRT1與P300 mRNA表達(dá)均未見明顯差異（P＞0.05）。與高糖組相比，高糖+中藥血清治療組SIRT1 mRNA表達(dá)相對(duì)增加，P300 mRNA表達(dá)相對(duì)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與短暫高糖組相比，短暫高糖+中藥血清治療組SIRT1 mRNA表達(dá)相對(duì)增加，P300 mRNA表達(dá)相對(duì)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高糖+中藥血清治療組、短暫高糖+中藥血清治療組比較，SIRT1與P300 mRNA表達(dá)均未見明顯差異（P＞0.05）。見圖 4（封四）。

4 討論

隨著我國人民生活水平大幅度提高，DM的發(fā)病率明顯上升，尤其是2型糖尿病的發(fā)病率大大增加[3]。糖尿病腎?。―N）是糖尿病最為常見，也是主要的微血管并發(fā)癥之一。臨床上早期高血糖引起的血管損傷在血糖控制到正常水平后仍繼續(xù)存在，并且可導(dǎo)致后期血管的病變，這一現(xiàn)象即稱之為“代謝記憶”[4]，表觀遺傳[5]可通過修飾及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來改變代謝記憶。DM由于長期的糖脂代謝紊亂，激活了持續(xù)的炎癥反應(yīng)，促使腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡，最終引起腎間質(zhì)細(xì)胞纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）。高血糖下受損細(xì)胞可招募炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎癥基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)生表觀遺傳。本實(shí)驗(yàn)在臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得明確療效的前提下[6-7]，運(yùn)用血清藥理學(xué)，從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度，通過高糖培養(yǎng)模擬代謝記憶，從表觀遺傳著手，探討益氣養(yǎng)陰活血湯對(duì)DN防治的部分作用機(jī)制。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-Mesenchymal transition，EMT）是TIF重要的發(fā)病機(jī)制之一，其中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-carherin是腎小管上皮細(xì)胞纖維化的重要觀察指標(biāo)之一，在EMT過程中可表現(xiàn)為E-carherin的表達(dá)丟失及α-SMA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)顯示，在高糖刺激下，α-SMA表達(dá)較低糖組明顯增加，提示出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，同時(shí)細(xì)胞間質(zhì)間緊密連接減弱，黏附分子E-carherin表達(dá)受抑制。細(xì)胞在高糖刺激16h后改為低糖培養(yǎng)，α-SMA表達(dá)較正常組仍有明顯升高，E-Cadherin表達(dá)較正常組略微減少，提示細(xì)胞在高糖刺激后改為低糖正常培養(yǎng)后仍存在轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象。中藥血清干預(yù)后，α-SMA表達(dá)減弱，E-carherin表達(dá)顯著增強(qiáng)。結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)NRK-52E細(xì)胞纖維化有治療作用。

轉(zhuǎn)錄共激活因子P300是一種重要的組蛋白乙?；?，而沉默信息調(diào)節(jié)子SIRT1是一種重要的組蛋白去乙酰化酶，組蛋白乙?；揎椩诒碛^遺傳修飾中起重要作用[8]。RT-PCR結(jié)果顯示，高糖組P300 mRNA表達(dá)較低糖組升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達(dá)較低糖組下降（P＜0.05），但高糖組與短暫高糖組比較，SIRT1與P300 mRNA表達(dá)均未見明顯差異（P＞0.05），提示短暫的高糖刺激，即可造成細(xì)胞的損傷，并且在短暫的高糖刺激后改低糖繼續(xù)培養(yǎng)48h后仍存在轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，可能存在對(duì)早期代謝狀態(tài)的記憶效應(yīng)[9]。在中藥血清干預(yù)后，高糖+中藥血清治療組P300 mRNA表達(dá)較高糖組下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達(dá)較高糖組上升（P＜0.05）。短暫高糖+中藥血清治療組P300 mRNA表達(dá)較短暫高糖組下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA 表達(dá)較短暫高糖組上升（P＜0.05）。高糖+中藥血清治療組與短暫高糖+中藥血清治療組比較，SIRT1與P300 mRNA表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰活血方可能同時(shí)通過抑制P300，刺激SIRT1表達(dá)進(jìn)行一個(gè)雙向調(diào)節(jié)，從而延緩纖維化的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰活血方含藥血清干預(yù)后NRK-52E細(xì)胞P300表達(dá)下調(diào)，SIRT1表達(dá)上升調(diào)，同時(shí)α-SMA表達(dá)下調(diào)，E-carherin表達(dá)上調(diào)，提示益氣養(yǎng)陰活血方可能抑制P300，同時(shí)刺激SIRT1表達(dá)，通過組蛋白乙?；揎椀母淖儊硪种蒲装Y相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[10]，減輕細(xì)胞凋亡及腎損傷。