重組蛋白檢測肺炎支原體IgM抗體分析

陳曦 趙芝娜

【摘 要】目的：用重組肺炎支原體P1蛋白檢測患兒血清中IgM抗體，探討該重組蛋白抗原在肺炎支原體感染早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：被動凝集實(shí)驗(yàn)檢測130例呼吸道感染患兒血清標(biāo)本，從中選出35例陽性血清標(biāo)本，用純化的重組肺炎支原體P1蛋白做抗原，間接ELISA方法分別檢測患兒血清中IgM和IgG抗體。結(jié)果：被動凝集實(shí)驗(yàn)檢測陽性率為33.1 %（43/130）。間接ELISA試驗(yàn) MpIgM抗體的陽性率為 91.4%（32/35） ，IgG抗體的陽性率為85.7%（30/35），兩種抗體檢出的陽性率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）且兩者陽性符合率為93.3%。結(jié)論：重組肺炎支原體P1蛋白抗原檢測IgM抗體提高了檢測的特異性和敏感性，適用于肺炎支原體感染的早期診斷。

【關(guān)鍵詞】肺炎支原體；重組蛋白；ELISA IgM抗體

【中圖分類號】R375.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）04-0-01

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是引起小兒呼吸道感染的常見病原菌[1]，引起的非典型肺炎起病緩慢，病程較長，感染后引起的合并癥復(fù)雜。由于對支原體分離培養(yǎng)困難而難以用于臨床診斷，臨床檢測主要依靠血清學(xué)方法和PCR。由于Mp細(xì)胞膜上的糖脂抗原與其它微生物及機(jī)體組織存在交叉抗原，其刺激集體產(chǎn)生抗體可與人的血清發(fā)生非特異性反應(yīng)。因此，血清學(xué)檢測方法中所用診斷抗原的質(zhì)量、檢測方法及檢測指標(biāo)的不同可直接影響血清學(xué)檢測結(jié)果的敏感性與特異性。有文獻(xiàn)報(bào)道用構(gòu)建的重組P1蛋白做抗原檢測臨床標(biāo)本中IgG抗體顯示出較好的特異性[2-3]。由于IgG抗體在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長，需雙份血清抗體滴度4倍以上升高才有診斷意義，不利于疾病的早期診斷。本研究用重組的肺炎支原體P1蛋白做抗原，ELISA檢測臨床標(biāo)本中的IgM抗體，并與檢測的IgG抗體及用肺炎支原體膜抗原被動凝集試驗(yàn)的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，以評價(jià)肺炎支原體重組P1蛋白抗原檢測IgM抗體在MP感染早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法：

1.1 材料

35份陽性血清標(biāo)本來自本院兒科門診呼吸道感染患兒被動凝聚試驗(yàn)43例陽性標(biāo)本中。10份正常人血清標(biāo)本采自門診健康人群。Mp FH P1重組蛋白抗原，P1蛋白免疫血清由中國醫(yī)科大學(xué)王桂珍教授惠贈；被動凝集法Mp抗體檢測試劑盒系富士瑞必歐株式會社產(chǎn)品（SEROIDR-MYCOⅡ） 。酶標(biāo)二抗（兔抗人IgM-HRP，IgG-HRP抗體）購自Sigma-aldrich。

1.2 標(biāo)本采集與保存

臨床標(biāo)本來源于本院兒科門診2015年11 月至2016年11月 呼吸道感染患兒130例，年齡在2-10歲，抽取靜脈血3ml，離心后分離血清，被動凝集實(shí)驗(yàn)測Mp抗體，被動凝集實(shí)驗(yàn)陽性標(biāo)本的血清（1：80 以上）置-80℃冰箱保存。

1.3 被動膠乳凝集試驗(yàn) 參照試劑盒說明書方法進(jìn)行。向第一孔加入100?l血清稀釋液，第2-8孔各加25?l血清稀釋液。向第一孔加入25?l待檢血清，混勻后吸出25?l 加到第二孔，依此類推做倍比稀釋。在第1孔加入未致敏粒子（鞣化的明膠粒子1：20）25?l，第2至8孔加入致敏粒子（肺炎支原體細(xì)胞膜抗原1：40）25?l，混勻，室溫置3小時(shí)，嚴(yán)格按照說明書判定結(jié)果，將顯示陽性（+）反應(yīng)圖像的最終稀釋倍數(shù)作為抗體滴度。

1.4 間接ELISA檢測患者血清中的IgM、IgG抗體 肺炎支原體P1蛋白抗原的純化與定量參見文獻(xiàn)[3]。采用方陣滴定法篩選出P1重組蛋白抗原的最佳包被濃度。參照文獻(xiàn)[1]對10份正常人血清進(jìn)行ELISA檢測，測定光吸收值（OD492）。每塊酶標(biāo)板均設(shè)空白孔（PBS），陰性對照孔（正常人血清）及陽性對照孔（被動凝集效價(jià)大于1：160的血清標(biāo)本），血清標(biāo)本均做1：100稀釋，并作雙孔檢測。根據(jù)計(jì)算出的平均OD值和標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)定臨界值。

用純化肺炎支原體P1重組蛋白包被酶標(biāo)板（含重組蛋白0.4ug/孔），加入1︰100 稀釋的待檢血清50 μl，置37 ℃水浴30 min，用洗滌液連續(xù)洗板5次，拍干，反應(yīng)孔內(nèi)加抗人Ig酶結(jié)合物（1：500 ）50 ?l，置37 ℃水浴30 min，洗板；每孔加入50 ?l底物液A和50 ?l底物液B，混勻，置37 ℃避光顯色10 min；每孔加入50 ?l終止液，用酶標(biāo)儀測吸光度A492值；結(jié)果判定：COV=陰性對照孔平均A492值×2.1倍。樣品A492值S/COV≥1為陽性，樣品A492值S/COV<1為陰性。

2 結(jié)果

2.1 被動凝集實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 在臨床檢測的130 份血清標(biāo)本中，被動凝集實(shí)驗(yàn)判斷為陽性標(biāo)本43例，陰性標(biāo)本76例，疑似病例（血清效價(jià)1：40）11例，檢測陽性率為33.1 %。其中5歲以下兒童血清標(biāo)本95例，血清陽性標(biāo)本效價(jià)大于1：80的31例，1：40的8例。陽性率為32.6% 。6-10歲血清標(biāo)本35例，陽性標(biāo)本12例。陽性率34.3%

2.2 重組蛋白抗原間接ELISA檢測血清中IgM、IgG結(jié)果 本研究選擇了35份被動凝集實(shí)驗(yàn)血清效價(jià)在1：80-320倍的陽性血清，用純化的P1蛋白做抗原，間接ELISA分別檢測肺炎支原體IgM和IgG抗體。

用方陣滴定法篩選重組蛋白的最佳包被濃度，重組P1蛋白的濃度為4ug/ml，采用P/N比率法對結(jié)果進(jìn)行判定：

P/N = 待檢血清標(biāo)本校正值 =待檢血清OD值 / 陽性參照標(biāo)本OD值

陰性標(biāo)本平均校正值 = 陰性血清平均OD值 / 陽性參照標(biāo)本OD值

P/N≥2.1時(shí)判斷為陽性，P/N<2.1為陰性，對1.5≤P/N<2.1的標(biāo)本按照同樣檢測條件重復(fù)檢測，排除假陽性。10份正常人血清平均OD值為0.0607。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)（P/N≥2.1為陽性，P/N<2.1為陰性）可知，待檢血清OD值0.1275（0.0607×2.1）以下為陰性，所測樣本中最大OD值為0.0661，屬于陰性，故10份正常人血清均為陰性，由此計(jì)算出的陰性血清標(biāo)本平均校正值為0.4651。

3 討論

病原菌感染后可刺激集體產(chǎn)生多種抗體，其中IgM抗體在血中出現(xiàn)早，消失快，往往被用做病原感染早期診斷的指標(biāo)。但感染產(chǎn)生的IgM抗體有時(shí)是非特異性的，臨床易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。選用特異的抗原檢測IgM抗體，則可提高檢測的特異性。本研究用重組的P1蛋白抗原檢測IgM抗體，由于其含有肺炎支原體特異的抗原表位[2]，因此可提高檢測的特異性。本實(shí)驗(yàn)用重組蛋白檢測10份正常人血清，沒有出現(xiàn)陽性結(jié)果。本研究檢測的130份臨床標(biāo)本被動凝集實(shí)驗(yàn)判斷為陽性標(biāo)本43例，檢測陽性率為33.1 %。其中判定為陰性標(biāo)本的病例中有11份可疑病例，血清效價(jià)為1：40 。我們選擇了35例實(shí)驗(yàn)陽性患兒血清做被檢測對象，檢測陽性率為91.4%。對80例新生兒肺炎患兒進(jìn)行IgM和IgG檢測，感染一周后檢測陽性率分別為97.5%和56.3%。

本實(shí)驗(yàn)中檢測的IgM抗體略高于IgG抗體的檢出率，可能原因是標(biāo)本采集于門診患兒，所選病例多數(shù)為5歲以下的兒童標(biāo)本，標(biāo)本采集時(shí)仍處于疾病的早期階段。對于有過支原體反復(fù)感染的兒童，IgM抗體檢出率會下降。Qu J等[5]對125例14-85歲疑似MP感染患者進(jìn)行定量PCR、分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種檢測方法在靈敏度、陽性預(yù)測值和陽性擬然比呈上升趨勢，但I(xiàn)gM檢測明顯低于培養(yǎng)法和定量PCR。除檢測方法的差異外，年長患者既往可能有過支原體感染，隨時(shí)間延長血清中IgM減少而IgG持續(xù)存在。支原體在咽部的定植存在也可產(chǎn)生一定濃度的IgG抗體。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用重組蛋白做抗原，ELISA法檢測患兒血清中的IgM抗體，可以用作小兒肺炎支原體感染的早期診斷。

參考文獻(xiàn)

趙芝娜，王桂珍** 董占雙 李保強(qiáng)。肺炎支原體P1黏附蛋白基因的克隆與表達(dá)。中國人獸共患病雜志，2005， VOL 21（6）：470-472. ISSN 1002-2694

宋煥景 王桂珍** 董占雙 劉忠順 吉兆華 周吉海 。肺炎支原體P1重組蛋白的提取純化及應(yīng)用研究。微生物學(xué)雜志，2007，27（3）：107-110