固定化脂肪酶ANL非水催化合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯

徐文婷，畢武丹，叢方地,，于琬琪，張樹林，楊 薇，羅 巍

(1.天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院 生物制藥系，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

L-抗壞血酸(Vc)，是一種天然活性成分，是較強的抗氧化劑之一，對環(huán)境無毒無害，易被人體消化吸收，廣泛用在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)[1]。它不溶于脂質(zhì)，穩(wěn)定性差。然而，Vc酯化后，形成Vc脂肪酸酯，不但具有脂溶性[2]，而且抗氧化性和穩(wěn)定性也顯著提高[3]，另外還有抗癌作用[4]，是世界上公認的安全無害的營養(yǎng)添加劑[5]。

Vc酯的制備通常有化學(xué)合成法和生物酶催化合成法[6]?；瘜W(xué)合成中，化學(xué)催化劑常帶入有毒物質(zhì)，需高溫、高壓條件，伴有副反應(yīng)發(fā)生及毒副性產(chǎn)物和非自然異構(gòu)體產(chǎn)生，還會嚴重污染環(huán)境[7-8]。酶法合成是利用脂肪酶，在有機溶劑中催化Vc與脂肪酸或其酯發(fā)生酯化或酯交換反應(yīng)生成Vc脂肪酸酯，具有環(huán)境友好、催化效率高、副反應(yīng)少、對設(shè)備要求不高、產(chǎn)品下游分離比較容易等優(yōu)點[4,9]。但脂肪酶在有機相中不穩(wěn)定，容易變性失活，且用于合成Vc酯的酶促反應(yīng)溫度通常高于50 ℃，此外，因反應(yīng)體系中使用了過量的脂肪酸，容易影響產(chǎn)物的提純及收率[4-6]。為提高酶非水相催化作用，通常制備固定化酶或酶生物反應(yīng)器，以提高其非水催化能力[10]，其理論依據(jù)為脂肪酶的界面活化機制，即在水/油(有機相)上，水相優(yōu)化穩(wěn)定化酶蛋白，有機相激活酶活性中心[11]。對于酶促合成Vc酯的研究，已取得了一定的進展[5-10]，但在提高酶活性、產(chǎn)物提純和降低催化溫度等方面，還有待進一步的研究。

為此，本文中，筆者以界面活化機制為基礎(chǔ)，選擇玻璃器壁和脫脂棉為載體，將黑曲霉菌脂肪酶Aspergillusnigerlipase(ANL)分別固定在器壁和脫脂棉纖維上，制備出固定化酶(器壁-ANL和脫脂棉-ANL)，并用于催化Vc與棕櫚酸發(fā)生酯化反應(yīng)，研究酶促合成Vc棕櫚酸酯的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

黑曲霉脂肪酶(ANL，12 000 U/g，源于黑曲霉菌Aspergillusniger)，杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；Vc、棕櫚酸、甲醇，市售分析純；高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1260 Infinity)，裝配HyPURITY -C18柱；HNY-100B型恒溫振蕩培養(yǎng)器，天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 HPLC分析方法

取反應(yīng)液2 μL，置于2 mL離心管內(nèi)，敞口放置10 min。使溶劑丙酮揮發(fā)完全后加入1 mL流動相，溶解，過濾膜(0.22 μm)，HPLC分析。叔丁醇作溶劑時，取樣后直接用流動相稀釋，過濾膜，進行HPLC分析。檢測波長254 nm，流速設(shè)為1.0 mL/min，進樣量20 μL。測得的Vc積分面積(S0)和Vc棕櫚酸酯積分面積(S1)用于計算反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率(c)，c=[S1/(S0+S1)]×100%。

1.3 ANL 固定化

稱10 mg ANL酶粉，加入10 mL棕色玻璃瓶中，再加0.2 mL蒸餾水，輕輕搖動，使ANL溶解。將玻璃瓶敞口，在160 r/min、37 ℃條件下保持8 h，得器壁-ANL。2 g脫脂棉先在100 mL乙醇中分別浸泡2次，每次24 h，取出后，待乙醇揮發(fā)完，取10 mg脫脂棉加入上述含ANL酶溶液的玻璃瓶中，充分吸附酶溶液，在上述同樣條件下固定化，后用鑷子將脫脂棉拉至蓬松，得脫脂棉-ANL。

1.4 丙酮中酶催化

稱0.01 g Vc，加入50 mL棕色容量瓶中，分次加丙酮，并振蕩，直至Vc全溶，定容至刻度，Vc質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。稱0.262 g棕櫚酸加入100 mL容量瓶中，加丙酮，振蕩，至固體全溶，定容至刻度，溶液質(zhì)量濃度為2.62 mg/mL。在含有ANL酶粉、器壁-ANL或脫脂棉-ANL的棕色瓶中(ANL質(zhì)量均為10 mg，下同)，加入上述Vc-丙酮溶液3 mL和棕櫚酸-丙酮溶液1 mL(Vc和棕櫚酸的摩爾比為1∶ 3)，蓋蓋，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反應(yīng)，按設(shè)定時間取樣分析。

1.5 叔丁醇中酶催化

在含器壁-ANL或脫脂棉-ANL的棕色瓶中，加入0.04 g Vc和0.18 g棕櫚酸(Vc和棕櫚酸的摩爾比約為1∶ 3)，再加入4 mL叔丁醇，蓋蓋，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反應(yīng)24 h。按時取樣分析。

1.6 底物等摩爾比的反應(yīng)

在含器壁-ANL或脫脂棉-ANL的棕色瓶中，加入0.2 mg/mL的Vc-丙酮溶液3 mL和2.62 mg/mL的棕櫚酸-丙酮溶液0.33 mL(Vc和棕櫚酸的摩爾比為1∶ 1)，蓋蓋，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反應(yīng)24 h。按時取樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)體系的HPLC分析結(jié)果

由于ANL酶的選擇性[12]，酶促酯化反應(yīng)在Vc的C6-羥基上優(yōu)先進行(圖1)。Vc在254 nm處有特征吸收[13]，以甲醇、水和微量冰醋酸組成流動相，在不同體積配比下，分析反應(yīng)體系的組分。圖2為兩種固定化酶反應(yīng)1 h后Vc和Vc棕櫚酸酯的HPLC分析圖。從保留時間、峰分離度及峰形等綜合考慮，最佳的流動相配比為V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)=75∶ 25∶ 0.1，Vc和Vc棕櫚酸酯的保留時間分別為3.17和4.02 min。

圖1 酶促合成Vc棕櫚酸酯Fig.1 Enzymatic synthesis of Vc palmitate

圖2 酶促反應(yīng)1 h后Vc和Vc棕櫚酸酯的HPLCFig.2 HPLC of Vc and Vc palmitate after enzymatic reaction for 1 h

2.2 ANL酶促酯化反應(yīng)

為研究固定化酶的催化反應(yīng)動力學(xué)，分別使用器壁-ANL和脫脂棉-ANL為催化劑，丙酮為溶劑，Vc與棕櫚酸的摩爾比為1∶ 3[14]。在較溫和的條件(37 ℃、160 r/min)下進行催化反應(yīng)，反應(yīng)動力學(xué)見圖3。

圖3 固定化ANL催化酯化動力學(xué)Fig.3 Kinetics of esterification catalyzed by immobilized ANL

由圖3可知：在開始階段，兩種固定化酶的催化活性相近，但器壁-ANL活性較高；1 h后，器壁-ANL轉(zhuǎn)化的底物相對較多；8 h后，相對于脫脂棉-ANL，器壁-ANL轉(zhuǎn)化底物的能力有所降低；24 h后，二者催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別為87.3%和90.4%?？梢?，脫脂棉-ANL的非水相催化活性更穩(wěn)定些。而近似條件下，酶粉ANL催化反應(yīng)24 h后底物轉(zhuǎn)化率僅為36.3%(表 1)。兩種固定化酶轉(zhuǎn)化底物的能力都是酶粉的2倍多。說明玻璃和棉纖維都有利于提高酶的催化活性，玻璃壁為極性材料，容易與酶蛋白結(jié)合以穩(wěn)定酶蛋白；脫脂棉為多羥基、大比表面積、柔性強、惰性且與蛋白有兼容性的天然材料[15]，這些特性類似水，有助于優(yōu)化和穩(wěn)定化酶蛋白。

2.3 溶劑和底物比對反應(yīng)的影響

合成Vc棕櫚酸酯時，為提高合成效果，通常以叔丁(戊)醇或丙酮為溶劑，反應(yīng)溫度定在50 ℃以上[16-17]。在較溫和的條件(37 ℃、160 r/min)下，使用2種不同的溶劑，反應(yīng)24 h，考察溶劑和底物比對反應(yīng)的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知：叔丁醇為溶劑時，脫脂棉-ANL、器壁-ANL催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率都較低，皆為18.5%。這可能是叔丁醇的分子結(jié)構(gòu)中含有羥基的原因，雖然經(jīng)過驗證，它不參與反應(yīng)[18]，但可能會干擾反應(yīng)[10]；另外，叔丁醇熔點高，在37 ℃下比較黏稠，沒有丙酮流動性好,不利于底物與酶蛋白之間的擴散。盡管Vc在叔丁醇中的溶解度相對較大些，但考慮到它不利于底物的轉(zhuǎn)化，且沸點高，不利于產(chǎn)物的分離和提純，所以選用丙酮作為溶劑用于合成Vc酯比較理想。

為增大反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，通常增加棕櫚酸的摩爾比例，在Vc和棕櫚酸的摩爾比(1∶ 3)～(1∶ 9)范圍內(nèi)，進行酶催化酯化反應(yīng)[17-19]，棕櫚酸摩爾比例的增加，雖然一定程度上提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，但卻增加了產(chǎn)物提純的難度，要把過量的棕櫚酸從產(chǎn)物中除去，就會降低產(chǎn)物的總收率。所以，最好能在底物比例為1∶ 1時進行有效的酶催化反應(yīng)，以便于產(chǎn)物的提純。當?shù)孜锉壤秊?∶ 1，且以丙酮為溶劑，24 h后器壁-ANL和脫脂棉-ANL催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別為51.8%和62.2%(表 1)。脫脂棉-ANL表現(xiàn)出較好的催化能力。如果適當延長催化反應(yīng)時間，加入吸水劑[20]，增大轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物的提純只需將溶劑蒸出即可。與ANL在樹脂上固定化及催化類似反應(yīng)體系的研究相比較[21]，器壁-ANL和脫脂棉-ANL不僅催化溫度低、搖動速度小、催化時間短、溶劑易除去，而且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率明顯高于前者(42.1%)。

表1 ANL催化反應(yīng)24 h后的轉(zhuǎn)化率

3 結(jié)論

為探索Vc棕櫚酸酯的低碳合成及純化工藝，制備了固定化脂肪酶器壁-ANL和脫脂棉-ANL。以固定化ANL為生物催化劑，Vc和棕櫚酸為底物，研究了酶促酯化反應(yīng)的動力學(xué)，并研究了溶劑、吸水劑和底物比例對酶促反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)：器壁-ANL和脫脂棉-ANL的催化能力大約是ANL酶粉的2倍，丙酮比叔丁醇更適合作為溶劑，脫脂棉-催化反應(yīng)24 h后的轉(zhuǎn)化率達90.4%。在底物摩爾比例為1∶ 1時，固定化酶仍保持較好的催化活性，24 h后，脫脂棉-ANL可以催化轉(zhuǎn)化62.2%的底物。該結(jié)果可以作為今后進行放大實驗的基礎(chǔ)，在底物摩爾比為1∶ 1時，通過加入吸水劑、適當延長反應(yīng)時間等，使反應(yīng)達到足夠的轉(zhuǎn)化率，然后通過蒸除溶劑得到較純凈的Vc棕櫚酸酯。