靜置的固定化熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)生物反應(yīng)器中催化合成乙酸香茅酯

張 蒙，叢方地,，任德忠,王曉紅，王鑫鑫，張樹林，羅 巍

(1.天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384; 2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

乙酸香茅酯屬于萜烯短鏈脂肪酸酯類化合物，作為天然香精和香料的重要組成成分[1]，存在于玫瑰油和香茅油中，具有檸檬氣味的鮮果香氣[2]，可以調(diào)制出多種香型香精，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)[3]，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前香茅酯的生產(chǎn)，除少部分從天然植物中提取，大部分為化學(xué)法合成[4-5]，但化學(xué)合成對(duì)反應(yīng)條件要求苛刻，且通常有副反應(yīng)發(fā)生等。所以，香茅酯的制備逐漸偏向生物法轉(zhuǎn)化[4]，特別是酶促合成法。因?yàn)槊复俸铣傻姆磻?yīng)條件溫和、選擇性高、副反應(yīng)少且對(duì)環(huán)境污染小。因而，酶促合成香茅酯的方法越來(lái)越受到重視。為更有效地酶促合成香茅酯，本文中，筆者將熒光假單胞菌脂肪酶Pseudomonasfluorescenslipase(PFL)固定在脫脂棉纖維上，與柱形瓶或滴定管形成簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器，并參考相關(guān)研究[6-13]，在非水相條件下，用于催化香茅醇與乙酸乙烯酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成乙酸香茅酯，研究瓶型生物反應(yīng)器和管式生物反應(yīng)器的催化活性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀盟A90型氣相色譜儀(GC，配有氫火焰檢測(cè)器和SE-30毛細(xì)管柱30 m×0.32 mm，0.33 μm)，上海儀盟電子科技有限公司；HZQ-Q型恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BSC-150型恒溫培養(yǎng)箱，杭州康納科技有限公司；FA2104A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

脂肪酶PFL(20 U/mg)，杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；香茅醇、乙酸乙烯酯、正己烷、無(wú)水乙醇及其他化學(xué)試劑為市售分析純。醫(yī)用脫脂棉購(gòu)于市場(chǎng)，試驗(yàn)前，取20 g脫脂棉置于250 mL燒杯中，向燒杯中加入無(wú)水乙醇至完全浸沒(méi)脫脂棉，將燒杯用封口膜密封，浸泡48 h。用鑷子取出，用乙醇洗2次，然后放入另一燒杯，用紗布封口，晾干，備用。

1.2 PFL的固定化

10 mg的PFL酶粉放入10 mL柱形玻璃瓶中，加200 μL蒸餾水，輕輕搖動(dòng)使酶粉充分溶解，再加10 mg脫脂棉，充分吸附酶溶液。此瓶敞口置于恒溫?fù)u床中，在37 ℃、160 r/min，保持8 h[9]，得固定在脫脂棉上的PFL——脫脂棉-PFL。用鑷子撕拉脫脂棉-PFL至蓬松，連同柱形瓶形成簡(jiǎn)易的脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器(圖1)，保鮮膜封口，備用。然后在表面皿中心部位加10 mg的PFL酶粉、200 μL蒸餾水，充分溶解，用10 mg脫脂棉充分吸附。將此表面皿置于恒溫箱中，在37 ℃保持50 min以上，用鑷子撕拉所得脫脂棉-PFL至蓬松，放于燒杯中，保鮮膜封口，備用。

1.3 酶促合成乙酸香茅酯

在含有脫脂棉-PFL和PFL酶粉的10 mL柱形玻璃瓶中，分別加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，在37 ℃、160 r/min下反應(yīng)。每個(gè)體系中的PFL酶粉的質(zhì)量均為10 mg。同時(shí)，按照上述方法準(zhǔn)備兩個(gè)同樣的反應(yīng)體系，在37 ℃下恒溫靜置。上述所有反應(yīng)體系，每隔2 h，取樣分析。此外，在7個(gè)脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中分別加入1 mL香茅醇、1～7 mL體積不等的乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，37 ℃恒溫靜置24 h，取樣分析。在5個(gè)脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中，分別加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，分別放在25、30、35、40和45 ℃靜置反應(yīng)24 h，取樣分析。

1.4 脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器再應(yīng)用

在脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中，分別加入1 mL 香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，37 ℃恒溫靜置24 h，取樣分析。然后，將反應(yīng)液倒出，并用正己烷沖洗3次，敞口放置 10 min，使殘余正己烷完全揮發(fā)。重新向反應(yīng)器中加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，在37 ℃靜置24 h，取樣分析。如此，操作共6次。

1.5 2種脫脂棉-PFL催化合成乙酸香茅酯

在脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中，加入1 mL香茅醇和2 mL乙酸乙烯酯，加蓋并用保鮮膜密封，在37 ℃靜置，并按時(shí)取樣分析。此外，在10 mL柱形玻璃瓶中，加入在表面皿中固定得到的脫脂棉-PFL(固定量：脫脂棉10 mg，PFL酶10 mg)，加入相應(yīng)量的反應(yīng)液，并在同樣條件下催化反應(yīng)，按時(shí)取樣分析。

1.6 脫脂棉-PFL在滴定管中催化合成乙酸香茅酯

在表面皿中固定得到的脫脂棉-PFL(固定量：脫脂棉50 mg，PFL酶50 mg)拉伸至蓬松，裝入酸式滴定管中。香茅醇與乙酸乙烯酯按體積比1∶ 2混合均勻，加入到酸式滴定管(圖1(b))中。放出1.5 mL反應(yīng)液后，驅(qū)趕氣泡，關(guān)閉開關(guān)并計(jì)時(shí)，1 h后，打開開關(guān)，將與脫脂棉-PFL接觸的反應(yīng)液(3 mL)放出，關(guān)閉開關(guān)，放出液取樣分析。此后，每隔2、3、4、5、6、8、14和16 h，分別放出反應(yīng)液，并取樣分析。

圖1 脫脂棉-PFL瓶型(a)和管式(b)反應(yīng)器

1.7 色譜分析方法

取樣 20 μL，用1 mL 正己烷稀釋，0.25 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣1 μL，GC 分析。色譜條件為N2(0.4 MPa，分流比1∶ 1)，110 ℃，保留 1 min；15 ℃/min，200 ℃，保留 1 min。進(jìn)樣和檢測(cè)溫度分別為280和 300 ℃。香茅醇和乙酸香茅酯的保留時(shí)間分別為4.4和5.5 min，根據(jù)它們的峰面積計(jì)算底物的摩爾轉(zhuǎn)化率[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖動(dòng)和靜置狀態(tài)下的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

在柱形瓶中，通過(guò)物理吸附作用，將脂肪酶PFL固定在脫脂棉上，形成固定化酶脫脂棉-PFL，并將其撕拉至蓬松，以增加其比表面積[10]，使反應(yīng)液與固定化酶接觸充分。脫脂棉-PFL與柱形瓶一起形成一種簡(jiǎn)易的瓶型生物反應(yīng)器，分別在搖動(dòng)和靜置條件下(37 ℃)，催化合成乙酸香茅酯，并與酶粉的催化效果相比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 脫脂棉-PFL和PFL酶粉的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(37 ℃)

由圖2可知，在搖動(dòng)和靜置條件下，脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中底物的轉(zhuǎn)化率明顯高于酶粉催化的體系。同時(shí)，在搖動(dòng)和靜置條件下，脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)化底物的能力相近。這可能是由于脫脂棉-PFL具有蓬松結(jié)構(gòu)和柔軟特性的原因，可以考慮優(yōu)先在靜置條件下催化合成乙酸香茅酯。

2.2 底物比對(duì)脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器催化作用的影響

香茅醇的量定為1 mL，乙酸乙烯酯的用量，由1 mL逐漸增加至7 mL[15]，反應(yīng)24 h，脫脂棉-PFL生物反應(yīng)器催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)乙酸乙烯酯為1 mL時(shí)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為86.0%；乙酸乙烯酯為2 mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.1%。乙酸乙烯酯用量進(jìn)一步加大，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率略有下降，但均在97%以上，這可能是增加乙酸乙烯酯造成底物香茅醇濃度降低的原因?？梢?jiàn)，香茅醇與乙酸乙烯酯的體積比為1∶ 2最適宜。

圖3 ?；噭┯昧繉?duì)酶促轉(zhuǎn)化率的影響(37 ℃，24 h)

2.3 溫度對(duì)脫脂棉-PFL生物反應(yīng)器催化作用的影響

設(shè)置5個(gè)溫度梯度，研究溫度對(duì)脫脂棉-PFL生物反應(yīng)器催化作用的影響。在靜置條件下催化反應(yīng)24 h，各個(gè)反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨溫度上升，轉(zhuǎn)化率顯著升高；在35和40 ℃，轉(zhuǎn)化率較高，達(dá)到98%以上。因此，酶促反應(yīng)的溫度可恒定在37 ℃進(jìn)行。

圖4 溫度對(duì)脫脂棉-PFL催化轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 6次脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器催化反應(yīng)24 h后的轉(zhuǎn)化率(a)和第6次催化后反應(yīng)液的氣相色譜圖(b)

2.4 脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器的重復(fù)利用

酶活性在非水相中容易因酶蛋白變性而降低[17]，為驗(yàn)證脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器的非水相穩(wěn)定性，循環(huán)使用它催化香茅醇與乙酸乙烯酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，每次催化24 h。以第1次催化后的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率作為酶的非水相初始活力[18]，即99.0%，第6次的轉(zhuǎn)化率作為衰減后的酶活力，即94.0%。后5次使用后反應(yīng)活力降低了5.0%，反應(yīng)的活力衰減率為5.0%÷(24×5)=0.04%，這是一個(gè)較小的數(shù)值[9]。可見(jiàn)，脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器在非水相條件下的活性是比較穩(wěn)定的，反應(yīng)器可以多次利用。重復(fù)使用時(shí)，基于脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器穩(wěn)定性的少許降低，可以通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來(lái)適當(dāng)提高酶生物反應(yīng)器的催化效率。

2.5 2種脫脂棉-PFL的催化效果

在柱形玻璃瓶中制備脫脂棉-PFL，因瓶口狹小，水分揮發(fā)相對(duì)較慢，在37 ℃、160 r/mim條件下固定10 mg的PFL需要8 h。而在表面皿上固定同量的PFL，只需37 ℃恒溫靜置90 min。在37 ℃靜置的柱形瓶中，2種脫脂棉-PFL催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)24 h，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在表面皿中固定得到的脫脂棉-PFL，活性相對(duì)較低，但催化反應(yīng)24 h后，轉(zhuǎn)化率也達(dá)到77.1%，活性低的原因，為脫脂棉-PFL從表面皿轉(zhuǎn)移到柱形瓶的過(guò)程中有損失，經(jīng)稱質(zhì)量得知酶的損失率約為9%。

圖6 2種方法制備的脫脂棉-PFL的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

2.6 脫脂棉-PFL在滴定管中催化反應(yīng)

脫脂棉-PFL不因靜置而明顯影響其催化活性，且在25 ℃時(shí)也表現(xiàn)出較好的活性。為此，可以將在表面皿中固定得到的脫脂棉-PFL裝入酸式滴定管形成管式生物反應(yīng)器進(jìn)行催化反應(yīng)。將脫脂棉-PFL(固定量：脫脂棉50 mg，PFL酶粉50 mg)拉至蓬松，小心地加入到酸式滴定管中，然后將香茅醇和乙酸乙烯酯按照1∶ 2的體積比充分混合，并加入到滴定管中催化反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 脫脂棉-PFL管式反應(yīng)器中催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率

由圖7可知，反應(yīng)4 h酶促轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到68.5%，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化率增加較慢。這可能因?yàn)槊撝?PFL區(qū)域的反應(yīng)液與沒(méi)有酶的上部區(qū)域的反應(yīng)液之間的擴(kuò)散有關(guān)。這種不足，可以通過(guò)以后進(jìn)一步的改進(jìn)裝置來(lái)提高轉(zhuǎn)化率，以達(dá)到應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的目的。

3 結(jié)論

通過(guò)在脫脂棉上固定PFL，制備固定化酶脫脂棉-PFL，并與反應(yīng)裝置一起形成簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器，催化香茅醇和乙酸乙烯酯(體積比1∶ 2)反應(yīng)合成乙酸香茅酯。在37 ℃、靜置條件下的脫脂棉-PFL瓶型生物反應(yīng)器中，催化反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96%以上。在室溫、靜置條件下的脫脂棉管式生物反應(yīng)器中，催化反應(yīng)4 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)68.5%。與傳統(tǒng)催化方法的強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫等催化條件相比，本方法反應(yīng)條件綠色、低碳且操作簡(jiǎn)單。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步改善反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，可望應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中去，形成一套低碳、高效、綠色環(huán)保的生產(chǎn)工藝。