沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克豬模型血清炎癥因子的變化特點(diǎn)

沈才福，劉江偉，夏亮，是文輝，董翔，安宗仁，段越

創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock，THS)時(shí)由于機(jī)體血容量銳減，微循環(huán)灌注不足，伴隨傷后劇烈疼痛、恐懼等各種因素，可引起代謝失調(diào)綜合征，甚至危及生命[1-2]。創(chuàng)傷失血性休克死亡發(fā)生率高[3]，有報(bào)道指出，伊拉克戰(zhàn)爭中87%的戰(zhàn)場死亡發(fā)生于到達(dá)醫(yī)院前，其中91%與失血性休克有關(guān)[4]。沙漠具有夏季氣溫高、晝夜溫差大、干燥等氣候特征。我國西北部地區(qū)分布著大面積的戈壁沙漠，總面積約為130萬平方公里[1,5]。本課題組前期研究表明，沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的損傷發(fā)生早且嚴(yán)重[1,5]，而炎癥反應(yīng)則是參與損傷甚至是威脅生命的關(guān)鍵因素。沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克時(shí)血清炎癥因子的變化特點(diǎn)目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)建立沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克模型，比較分析沙漠干熱環(huán)境和常溫環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克病程中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10等炎癥因子的變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 分組及主要材料 9周齡本地雄性長白仔豬40只，體重25～35kg，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司提供。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為常溫假手術(shù)組(NS組)、常溫創(chuàng)傷失血性休克組(NTHS組)、干熱假手術(shù)組(DS組)、干熱創(chuàng)傷失血性休克組(DTHS組)，每組10只。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒購自上海喬伊生物科技有限公司。環(huán)境模擬置于新疆軍區(qū)總醫(yī)院自主研制的“西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙”內(nèi)。

1.2 模型建立 按以上分組將實(shí)驗(yàn)動物分別置于已提前設(shè)置相應(yīng)環(huán)境(常溫環(huán)境：溫度25.0±0.5℃，濕度35%±5%；沙漠干熱環(huán)境：溫度40.5±0.5℃，濕度10%±2%)的實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)暴露3h。采用氯胺酮20mg/kg、阿托品0.05mg/kg肌內(nèi)注射誘導(dǎo)麻醉，以1.5%～3.0%七氟烷混入50%的氧氣中維持麻醉，連接心電監(jiān)護(hù)，BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測體溫。麻醉滿意后，分離暴露右側(cè)頸外靜脈，插入漂浮導(dǎo)管以監(jiān)測血流動力學(xué)及取混合靜脈血液樣本，并于右側(cè)股動脈插管監(jiān)測動脈血壓，左側(cè)股動脈用于放血及血液樣本的采集。中線開腹、膀胱造瘺。NTHS組和DTHS組行脾切除術(shù)及左下葉部分肝臟切除術(shù)、稱重，并輸入3倍脾重的乳酸林格液[6-7]。休克模型采用固定血壓的中度創(chuàng)傷失血性休克模型[8]，自髂外動脈快速放血致平均動脈壓(MAP)為45±5mmHg，穩(wěn)定20min后記錄為休克0h，穩(wěn)定期間可通過再放血或靜脈輸入乳酸林格液穩(wěn)定目標(biāo)血壓。NS組和DS組按照上述方法完成監(jiān)測后，行剖腹術(shù)及膀胱造瘺術(shù)后結(jié)束手術(shù)操作，未予創(chuàng)傷失血性休克處理，故無切脾切肝及輸入乳酸林格液等步驟。NS組在NTHS組存活最長時(shí)間基礎(chǔ)上延長約30min后處死，DS組在DTHS組存活最長時(shí)間的基礎(chǔ)上延長約30min后處死。模型建立示意圖見圖1。

圖1 創(chuàng)傷失血性休克豬模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of traumatic hemorrhagic shock porcine model

1.3 標(biāo)本收集與處理 暴露前、暴露后、休克0h及休克后每30min采集靜脈血液，直至動物自然死亡，靜置30min，3000r/min離心10min后儲存于–20℃冰箱中待測。

1.4 標(biāo)本檢測 分別將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100μl/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(25～28℃)孵育120min；5次洗板后加入生物素化抗體工作液(100μl/孔)孵育60min；洗板5次后加入HRP酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)孵育20min；再洗板后加入顯色劑TMB(100μl/孔)避光孵育20min，加入終止液50μl/孔，混勻后于酶標(biāo)儀測量波長450nm處所有孔板的光密度(A)值，計(jì)算TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用重復(fù)測量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在實(shí)驗(yàn)過程中，所有實(shí)驗(yàn)動物均未發(fā)生手術(shù)或麻醉意外。DTHS組實(shí)驗(yàn)動物的生存時(shí)間為3h左右，NTHS組的生存時(shí)間長達(dá)10.5h[5]。故本研究中干熱環(huán)境組留取了暴露后及休克后0、1、2、3h共5個時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本，而常溫環(huán)境組增加休克后8h(TNF-α為6h)及10h兩個時(shí)間點(diǎn)。

2.1 血清TNF-α水平變化 NS組血清TNF-α水平呈逐漸上升趨勢，但各時(shí)間點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NTHS組休克后血清TNF-α水平逐漸上升，至6h達(dá)峰值并明顯高于NS組(P＜0.05)，此后逐漸下降。DS組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DTHS組血清TNF-α水平自休克后迅速上升，在休克后1h左右達(dá)峰值，且明顯高于NTHS組及DS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨后逐漸下降(表1)。

2.2 血清IL-1β水平變化 NS組血清IL-1β水平各時(shí)間點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NTHS組血清IL-1β水平隨時(shí)間延長逐漸上升，且從休克后1h起即明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并于8h左右達(dá)峰值。干熱環(huán)境暴露后DS組和DTHS組血清IL-1β水平高于常溫暴露的NS組和NTHS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。觀察期間DS組血清IL-1β水平始終呈增長趨勢，DTHS組休克后血清IL-1β水平快速升高，于休克后1h即明顯高于NTHS組和DS組(P＜0.05)，休克后2h達(dá)峰值，休克后3h明顯降低，與NTHS組和DS組比較差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表1 各組血清TNF-α水平 (pg/mg，，n=10)Tab.1 Serum levels of TNF-α in each group (pg/mg, , n=10)

表1 各組血清TNF-α水平 (pg/mg，，n=10)Tab.1 Serum levels of TNF-α in each group (pg/mg, , n=10)

AE.After exposure; NS.Normal temperature sham group; NTHS.Normal temperature traumatic hemorrhagic shock group; DS.Dry-heat sham group; DTHS.Dry-heat traumatic hemorrhagic shock group.(1)P＜0.05 compared with NS group; (2)P＜0.05 compare with NTHS group; (3)P＜0.05 compare with DS group

Group AE 0h 1h 2h 3h 6h 10h NS 23.7±6.8 24.7±10.5 25.3±7.8 26.3±7.1 27.3±12.4 28.3±8.6 30.5±15.4 NTHS 25.1±9.9 23.6±12.9 32.8±10.9 34.3±15.0 34.1±15.1 68.0±19.4(1) 35.2±18.7 DS 37.2±17.9(1) 39.9±12.8(1) 40.4±15.5(1) 41.9±16.1(1) 42.2±10.8(1) – –DTHS 40.4±10.0(1) 38.6±7.4(1)(2) 66.9±14.6(1)(2)(3) 53.5±11.4(1)(2) 35.6±8.1(1) – –

2.3 血清IL-6水平變化 NS組休克后血清IL-6水平呈逐漸上升趨勢，至休克后3h即明顯高于暴露后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NTHS組休克后血清IL-6水平始終呈較快升高趨勢。干熱環(huán)境暴露后DS組和DTHS組血清IL-6水平明顯高于常溫暴露的NS組和NTHS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DTHS組休克后血清IL-6水平逐漸升高，且在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于NTHS組(P＜0.05)，但從休克后2h起才高于DS組(P＜0.05，表3)。

表2 各組血清IL-1β水平 (pg/mg，，n=10)Tab.2 Serum levels of IL-1β in each group (pg/mg, , n=10)

表2 各組血清IL-1β水平 (pg/mg，，n=10)Tab.2 Serum levels of IL-1β in each group (pg/mg, , n=10)

AE.After exposure; NS.Normal temperature sham group; NTHS.Normal temperature traumatic hemorrhagic shock group; DS.Dry-heat sham group; DTHS.Dry-heat traumatic hemorrhagic shock group.(1)P＜0.05 compared with NS group; (2)P＜0.05 compare with NTHS group; (3)P＜0.05 compare with DS group

Group AE 0h 1h 2h 3h 8h 10h NS 62.9±15.3 64.7±20.7 61.6±21.2 54.6±21.4 65.6±20.8 63.5±15.6 68.4±6.9 NTHS 68.9±16.8 63.2±19.7 78.1±13.5(1) 85.6±23.4(1) 97.6±18.0(1) 157.8±30.9(1) 122.9±40.4(1)DS 79.5±13.3 83.8±19.4 85.8±13.2(1) 88.7±19.4(1) 96.3±17.5(1) – –DTHS 84.7±22.8 99.8±14.7(1)(2) 149.1±21.6(1)(2)(3) 157.8±19.7(1)(2)(3) 95.1±19.3(1) – –

2.4 血清IL-10水平變化 NS組及NTHS組休克后血清IL-10水平逐漸升高，休克后8、10h明顯高于暴露后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NTHS組休克后血清IL-10水平增長較快，自2h起及明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干熱環(huán)境暴露后DS組和DTHS組血清IL-10水平明顯高于常溫暴露的NS組和NTHS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DS組和DTHS組休克后血清IL-10水平均逐漸上升，但DTHS組上升速度更快，休克后1h即達(dá)峰值，且在1、2、3h時(shí)間點(diǎn)均明顯高于DS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表4)。

表3 各組血清IL-6水平比較(pg/mg，，n=10)Tab.3 Serum levels of IL-6 in swine (pg/mg, , n=10)

表3 各組血清IL-6水平比較(pg/mg，，n=10)Tab.3 Serum levels of IL-6 in swine (pg/mg, , n=10)

AE.After exposure; NS.Normal temperature sham group; NTHS.Normal temperature traumatic hemorrhagic shock group; DS.Dry-heat sham group; DTHS.Dry-heat traumatic hemorrhagic shock group.(1)P＜0.05 compare with AE; (2)P＜0.05 compared with NS group; (3)P＜0.05 compare with NTHS group; (4)P＜0.05 compare with DS group

Group AE 0h 1h 2h 3h 8h 10h NS 34.5±14.5 38.7±10.5 41.3±15.9 42.4±13.9 50.6±14.7(1) 114.8±19.1(1) 152.9±24.3(1)NTHS 38.1±18.2 42.8±16.9 54.0±17.3 59.6±24.8 95.9±21.8(2) 505.4±34.7(2) 826.4±28.0(2)DS 90.6±20.5(2)(3) 110.1±20.0(2)(3) 114.4±27.5(2)(3) 124.8±19.4(2)(3) 139.4±23.8(2)(3) – –DTHS 91.7±18.5(2)(3) 101.4±19.4(2)(3) 121.4±19.2(2)(3) 186.4±27.9(2)(3)(4) 354.8±27.1(2)(3)(4) – –

表4 各組血清IL-10水平比較(pg/mg，，n=10)Tab.4 Serum levels of IL-10 in swine (pg/mg, , n=10)

表4 各組血清IL-10水平比較(pg/mg，，n=10)Tab.4 Serum levels of IL-10 in swine (pg/mg, , n=10)

AE.After exposure; NS.Normal temperature sham group; NTHS.Normal temperature traumatic hemorrhagic shock group; DS.Dry-heat sham group; DTHS.Dry-heat traumatic hemorrhagic shock group.(1)P＜0.05 compare with AE; (2)P＜0.05 compared with NS group; (3)P＜0.05 compare with NTHS group; (4)P＜0.05 compare with DS group

Group AE 0h 1h 2h 3h 8h 10h NS 35.7±13.3 33.8±15.6 35.6±16.3 40.8±16.0 45.7±22.9 70.0±21.3(1) 75.8±15.1(1)NTHS 34.8±12.0 26.4±11.2 47.7±25.5 69.9±23.2(2) 114.2±25.2(2) 205.8±22.7(1)(2)242.8±21.1(1)(2)DS 56.5±25.3(2)(3) 60.0±27.8 68.7±27.8 83.6±10.8 86.9±14.6 – –DTHS 54.5±23.9(2)(3) 43.3±24.9 190.5±28.3(2)(3)(4) 126.8±19.7(2)(3)(4) 77.2±10.6(3)(4) – –

3 討 論

熱應(yīng)激、創(chuàng)傷、失血性休克均可通過直接或者間接作用損傷機(jī)體，導(dǎo)致多臟器功能損傷。炎癥是多種疾病的共同通路，受多種應(yīng)激因素的影響，多種細(xì)胞分子參與了炎癥反應(yīng)的應(yīng)答過程，在細(xì)胞水平包括中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等[9-10]，在分子水平包括絲裂原活化蛋白酶(MAPs)、細(xì)胞黏附分子(CAMs)[11]等。促炎介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α為常用的評價(jià)炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，其中TNF-α是最早且最關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)[10]。本研究中NTHS組血清TNF-α水平在休克后6h達(dá)峰值，而DTHS組在休克后1h即達(dá)峰值，且熱暴露后血清TNF-α水平高于常溫組，提示熱應(yīng)激與THS的復(fù)合作用，提前啟動了炎癥因子的釋放并提高了其釋放濃度。TNF-α對啟動炎癥反應(yīng)起著決定性的作用[12-13]，因此在TNF-α釋放后，一般會相繼出現(xiàn)大量IL-1β、IL-6等炎癥級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[10]。本研究中NTHS組在TNF-α大量釋放后，相繼出現(xiàn)IL-1β、IL-6的大量釋放，與其他研究結(jié)果一致[6,12]。但由于干熱應(yīng)激與THS的雙重打擊，DTHS組的血清IL-1β、IL-6水平升高緊隨TNF-α水平升高之后，提示與常溫環(huán)境下的THS相比，其炎癥“瀑布式爆發(fā)”的時(shí)間更早、病情發(fā)展更快、預(yù)后更差。

促炎因子釋放的同時(shí)也會刺激抑炎因子(如IL-10)的釋放，以抵抗多種促炎因子對臟器的損傷，在機(jī)體免疫平衡中具有重要作用[12]。本研究中由于干熱的環(huán)境刺激，DS組和DTHS組暴露后血清IL-10水平均明顯高于NS組和NTHS組，考慮是由于熱環(huán)境刺激引起的免疫應(yīng)答所致，也可能正是由于這種免疫應(yīng)答機(jī)制在干熱環(huán)境暴露時(shí)提前激活，導(dǎo)致DTHS組血清IL-10水平在休克后1h左右就迅速達(dá)到峰值，而NTHS組從休克0h開始逐漸升高，至休克后8h才達(dá)峰值。

創(chuàng)傷失血性休克可刺激機(jī)體釋放大量的炎癥介質(zhì)，使機(jī)體發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征，最終引起多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)[14]。在本研究中，沙漠干熱環(huán)境的打擊作用使THS豬過早、過量地釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等炎癥因子，從而使其比常溫環(huán)境下THS豬的炎癥瀑布樣連鎖放大反應(yīng)發(fā)生時(shí)間更早，對臟器損傷更嚴(yán)重，病情發(fā)展更快，預(yù)后更差。

本研究成功建立了沙漠干熱環(huán)境THS豬模型，與本課題組前期建立的沙漠干熱環(huán)境THS大鼠[1]相比，豬具有與人類相似的心血管反應(yīng)[15]，體積更大，易于操作，標(biāo)本量易收集，建模成功率更高。但豬的脾臟較大(約為人類的3倍)[8,15]，存儲的血液較多，在失血性休克時(shí)更易發(fā)生自體輸血，所以許多研究者在建模時(shí)會切除豬的脾臟并輸入3倍體積的乳酸林格液[16-17]來平衡體液的丟失。乳酸林格液是與人類組織液離子濃度相似的等張液，大量輸注后對炎癥因子、凝血因子等具有稀釋作用。常溫和干熱環(huán)境下的THS組暴露后到休克后1h血清TNF-α、IL-10水平均有所下降，推測主要與乳酸林格液的稀釋作用有關(guān)；失血性休克后組織液的自體回輸可能是導(dǎo)致休克后炎癥因子濃度降低的另一個原因。因此THS豬早期血清炎癥因子濃度不高或者降低可能是稀釋性的，并不能準(zhǔn)確反映機(jī)體的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，因此在綜合分析炎癥因子變化趨勢時(shí)應(yīng)予以考慮。

雖然對沙漠干熱環(huán)境THS的發(fā)展過程、病理生理機(jī)制尚未完全清晰，但本研究結(jié)果提示沙漠干熱環(huán)境的應(yīng)激作用和THS的雙重打擊在全身炎癥反應(yīng)及其病理生理發(fā)展過程中扮演著重要角色，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。