菊苣酸對(duì)活性氧誘導(dǎo)脂質(zhì)和DNA氧化損傷的影響

肖海芳，付晶晶，王友玲，李凡玥，宋元達(dá)

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000）

當(dāng)機(jī)體受到各種有害因素的刺激時(shí)，體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被破壞，引起自由基的蓄積，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[1-2]。過量自由基攻擊體內(nèi)脂蛋白、脂質(zhì)體、微粒體和細(xì)胞膜等引起脂質(zhì)過氧化[3-5]。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能夠改變生物膜的完整性和滲透性，并使其結(jié)構(gòu)改變、功能喪失[6]；低密度脂蛋白發(fā)生脂質(zhì)過氧化后結(jié)構(gòu)改變，其氧化產(chǎn)物具有促動(dòng)脈粥樣化和促炎作用[7]。另外，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物還具有致突變、致癌等毒性[8]。研究證明，脂質(zhì)過氧化是心腦血管疾病、癌癥、神經(jīng)失調(diào)和衰老等疾病的潛在誘因[9-11]。肝臟組織和腦組織作為動(dòng)物體內(nèi)重要的器官，在自由基誘導(dǎo)作用下能夠發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝臟和腦組織損傷。丙二醛（malondialdehyde，MDA）一直被視為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)記物，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）能夠與MDA反應(yīng)，生成粉紅色化合物，該物質(zhì)在532 nm波長處有吸收峰，因此通過分光光度法對(duì)其濃度進(jìn)行檢測非常簡單、快捷[12]。

除脂質(zhì)過氧化外，氧化應(yīng)激也會(huì)引起蛋白氧化損傷和DNA鏈斷裂、DNA堿基修飾等形式的氧化損傷[13]。另外，脂質(zhì)過氧化次級(jí)產(chǎn)物活性羰基化合物能夠修飾蛋白和DNA等生物大分子[14-15]。DNA作為人類最重要的遺傳物質(zhì)，其氧化損傷能加速細(xì)胞的衰老、凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、炎癥和癌癥等疾病的發(fā)生[16-18]。研究證實(shí)，阿爾茨海默癥患者腦組織中DNA氧化產(chǎn)物的水平明顯升高[19]。

許多研究者致力于尋找有效的天然抗氧化劑，以減輕自由基對(duì)機(jī)體生物大分子的氧化損傷[20-21]。菊苣酸是來源于菊苣和紫錐菊等植物的一種多酚類化合物，具有多種功能活性[22-23]，但目前鮮有其抗氧化活性的系統(tǒng)報(bào)道。研究顯示，灌胃菊苣酸后，在SD大鼠肝臟和腦組織中檢測到菊苣酸[24]?；谝陨?，本實(shí)驗(yàn)擬從生物大分子角度系統(tǒng)研究菊苣酸的抗氧化活性。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菊苣酸對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。本研究將進(jìn)一步以小鼠肝勻漿和小鼠腦勻漿為脂質(zhì)模型，以鯡魚精DNA和pBR322質(zhì)粒DNA為DNA模型，通過Cu2＋/H2O2和2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）分別誘導(dǎo)其氧化損傷，探討菊苣酸對(duì)脂質(zhì)和DNA氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康雄性SPF級(jí)昆明小鼠15 只，體質(zhì)量（20±2）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（陜）2007-001。實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠的飼養(yǎng)管理按照國家相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

菊苣酸（純度≥98%）、AAPH 美國Sigma公司；pBR322質(zhì)粒DNA 大連寶生物工程有限公司；鯡魚精DNA 北京百瑞金生物科技有限公司；TBA 美國TEDIA公司；三氯乙酸 天津市博迪化工有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；DY89-Ⅱ型勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；5419R型高速離心機(jī)、移液槍 德國Eppendorf公司；680型酶標(biāo)儀、PowerPac 220 V電泳供電裝置、水平電泳槽、ChemiDox XRS凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；－80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型萬分之一天平 德國Sartorius公司；VORTEX-5型漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；生化分析型超純水機(jī) 成都優(yōu)普凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠組織勻漿的制備

實(shí)驗(yàn)前昆明小鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水。將禁食過夜的昆明小鼠斷頸處死，固定于泡沫板上，摘取肝臟組織和腦組織。用無菌生理鹽水洗去表面血污，剔除脂肪及結(jié)締組織。稱取小鼠肝臟組織或腦組織，用眼科剪將其剪碎后加入生理鹽水（1 g組織加入9 g生理鹽水），然后置于冰浴中勻漿5 min。將得到的組織勻漿3 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液分裝，－80 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)檢測小鼠肝勻漿和腦勻漿的脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.32%和0.50%。

1.3.2 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)組織勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響

向多支離心管中分別加入組織勻漿（脂質(zhì)終質(zhì)量濃度為2 mg/mL）和終濃度為10、100、500、1 000 μmol/L的菊苣酸溶液，混勻后加入終濃度分別為25.0、0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白對(duì)照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替H2O2和CuSO4溶液，氧化模型對(duì)照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液?；靹蚝髮⒏麟x心管于37 ℃孵育90 min，檢測組織勻漿脂質(zhì)過氧化程度。

1.3.3 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)組織勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響

菊苣酸與組織勻漿的處理方法同1.3.2節(jié)。一定體積AAPH溶液經(jīng)熱分解后分別加入各離心管中，使其終濃度為100 mmol/L；空白對(duì)照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替AAPH溶液，氧化模型對(duì)照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。混勻后將各離心管于37 ℃孵育4 h，檢測組織勻漿脂質(zhì)過氧化程度。

1.3.4 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

一定體積鯡魚精DNA（終質(zhì)量濃度為2 mg/mL）或pBR322 DNA（終質(zhì)量濃度為20 ng/μL）分別與終濃度為25、50、100、200 μmol/L的菊苣酸溶液混合均勻，封口膜封口后置于37 ℃水浴中孵育30 min，然后分別向各樣品中加入終濃度分別為1.0、0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白對(duì)照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替H2O2和CuSO4溶液，氧化模型對(duì)照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。混勻后將各樣品于37 ℃孵育90 min，檢測DNA氧化損傷程度。

1.3.5 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

DNA與菊苣酸的處理方法同1.3.4節(jié)。終濃度為10 mmol/L的AAPH溶液熱分解后加入各樣品中，空白對(duì)照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替AAPH溶液，氧化模型對(duì)照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。將各樣品于37 ℃孵育4 h，檢測DNA氧化損傷程度。

1.3.6 脂質(zhì)過氧化水平測定

通過TBA法檢測組織勻漿脂質(zhì)過氧化程度[25]。向100 μL處理好的脂質(zhì)樣品中分別加入400 μL 20%的三氯乙酸溶液和400 μL 0.67%的TBA溶液，混勻，置于沸水浴中15 min。冷卻后5 000 r/min離心10 min。取上清液于532 nm波長處測吸光度。最終結(jié)果以脂質(zhì)過氧化程度表示，根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式中：As為樣品組在532 nm波長處的吸光度，At為Cu2＋/H2O2或AAPH單獨(dú)處理組在532 nm波長處的吸光度。

1.3.7 鯡魚精DNA氧化損傷的測定

采用TBA法檢測鯡魚精DNA氧化損傷程度[21]，具體操作同1.3.6節(jié)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果以鯡魚精DNA氧化損傷程度表示，計(jì)算公式同式（1）。

1.3.8 DNA瓊脂糖凝膠電泳

取處理好的DNA反應(yīng)液，加入2 μL上樣緩沖液，混合均勻，上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100 V，時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束后，采用CHEMIDOCXRS凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片成像，采用Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析，定量結(jié)果以超螺旋pBR322 DNA相對(duì)含量表示，根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式中：Hc為超螺旋pBR322 DNA條帶灰度；Hk為開環(huán)pBR322 DNA條帶灰度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣酸對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響

圖1 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響Fig. 1 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced lipid peroxidation of mouse liver homogenate

圖2 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響Fig. 2 Effect of chicoric acid on AAPH-induced lipid peroxidation of mouse liver homogenate

作為人體最重要的代謝器官，肝臟中脂質(zhì)受到自由基攻擊后易發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起肝細(xì)胞損傷。動(dòng)物肝勻漿常被用作脂質(zhì)模型研究活性物質(zhì)的抗氧化作用[26-27]。由圖1、2可以看出，Cu2＋/H2O2和50 mmol/L AAPH單獨(dú)處理后，小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化水平與空白對(duì)照組相比均明顯升高。加入10～1 000 μmol/L菊苣酸孵育后，Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)體系中小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化水平呈不同程度的下降趨勢，并且在10～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)存在濃度依賴關(guān)系，而濃度為1 000 μmol/L的菊苣酸雖然對(duì)組織勻漿脂質(zhì)過氧化也有一定的抑制作用，但與500 μmol/L菊苣酸相比作用效果減弱。上述結(jié)果說明，菊苣酸在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化，但在高濃度時(shí)抑制作用減弱。在AAPH誘導(dǎo)體系中，10 μmol/L菊苣酸對(duì)小鼠肝勻漿無明顯保護(hù)作用，但100～1 000 μmol/L濃度的菊苣酸對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化均具有明顯抑制效果，且呈濃度依賴關(guān)系。

2.2 菊苣酸對(duì)小鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響

除脂肪組織外，腦是人體脂肪含量最高的組織。腦組織中脂質(zhì)極易受到自由基破壞，導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。由圖3、4可以看出，Cu2＋/H2O2和AAPH誘導(dǎo)體系均能明顯升高小鼠腦勻漿的脂質(zhì)過氧化水平。在Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)體系中，10～1 000 μmol/L菊苣酸均能明顯降低小鼠腦勻漿的氧化損傷程度，提示菊苣酸對(duì)小鼠腦勻漿具有明顯的保護(hù)作用；與圖1結(jié)果相似，濃度為1 000 μmol/L的菊苣酸對(duì)小鼠腦勻漿的保護(hù)效果也明顯減弱。在AAPH誘導(dǎo)體系中，菊苣酸在10～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠腦勻漿均具有明顯的保護(hù)作用，且濃度越高，菊苣酸對(duì)小鼠腦勻漿的保護(hù)效果越強(qiáng)。

圖3 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)小鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響Fig. 3 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced lipid peroxidation of mouse brain homogenate

圖4 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)小鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化水平的影響Fig. 4 Effect of chicoric acid on AAPH-induced lipid peroxidation of mouse brain homogenate

2.3 菊苣酸對(duì)鯡魚精DNA氧化損傷的影響

DNA是活性氧自由基攻擊的重要靶分子之一。受到自由基攻擊后，DNA發(fā)生堿基修飾和鏈斷裂，DNA氧化損傷與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。自由基攻擊DNA會(huì)產(chǎn)生MDA和大量的氧化產(chǎn)物。其中MDA可與TBA反應(yīng)生成硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）。由于TBARS在532 nm波長處有最大吸收峰，因此，可通過532 nm波長處吸光度衡量DNA樣品氧化損傷的程度[28]。532 nm波長處吸光度越大，表明DNA樣品氧化損傷越嚴(yán)重。圖5、6結(jié)果顯示，Cu2＋/H2O2和AAPH誘導(dǎo)后鯡魚精DNA氧化損傷程度均明顯上升。25～100 μmol/L菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)體系中鯡魚精DNA具有較好的保護(hù)作用，但濃度升至100 μmol/L時(shí)菊苣酸對(duì)其保護(hù)效果開始呈減弱趨勢；當(dāng)濃度增加為200 μmol/L時(shí)，菊苣酸的保護(hù)作用消失。25～200 μmol/L菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)的鯡魚精DNA氧化損傷均具有明顯的保護(hù)作用，且濃度越高，菊苣酸的保護(hù)效果越強(qiáng)。

圖5 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)鯡魚精DNA氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to herring sperm DNA

圖6 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)鯡魚精DNA氧化損傷的影響Fig. 6 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to herring sperm DNA

2.4 菊苣酸對(duì)pBR322 DNA氧化損傷的影響

圖7 菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)pBR322 DNA氧化損傷的影響Fig. 7 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to pBR322 DNA

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測pBR322 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)向開環(huán)結(jié)構(gòu)及線性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，以反映DNA的氧化損傷程度[29]。由圖7可見，空白對(duì)照組pBR322 DNA幾乎全部以超螺旋結(jié)構(gòu)存在，而經(jīng)Cu2＋/H2O2處理90 min后，以開環(huán)形式存在的pBR322 DNA明顯增多，說明Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)體系產(chǎn)生的羥自由基使pBR322 DNA發(fā)生氧化損傷，并破壞其超螺旋結(jié)構(gòu)。以1～10 μmol/L菊苣酸孵育后，具有超螺旋結(jié)構(gòu)的pBR322 DNA明顯增多，并呈濃度依賴關(guān)系。雖然50 μmol/L菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)pBR322 DNA氧化損傷也有一定的保護(hù)作用，但與10 μmol/L菊苣酸處理組相比保護(hù)作用降低；100μmol/L菊苣酸對(duì)Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)pBR322 DNA氧化損傷無保護(hù)作用，甚至表現(xiàn)出促氧化作用。上述結(jié)果說明，菊苣酸在低濃度時(shí)能夠抑制Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)pBR322 DNA氧化損傷，但在高濃度時(shí)具有促氧化作用。圖8為菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)體系中pBR322 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的影響。

圖8 菊苣酸對(duì)AAPH誘導(dǎo)pBR322 DNA氧化損傷的影響Fig. 8 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to pBR322 DNA

由圖8可以看出，10 mmol/L AAPH單獨(dú)處理后，pBR322 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)明顯被破壞。pBR322 DNA經(jīng)1～200 μmol/L菊苣酸孵育后，其超螺旋結(jié)構(gòu)明顯增多；菊苣酸濃度為25～200 μmol/L時(shí)，以超螺旋結(jié)構(gòu)形式存在的pBR322 DNA與空白對(duì)照組相比無明顯差異。

3 結(jié) 論

本研究以不同濃度菊苣酸分別孵育脂質(zhì)和DNA模型，通過Cu2＋/H2O2產(chǎn)生的羥自由基和AAPH產(chǎn)生的烷氧自由基誘導(dǎo)后，分析菊苣酸對(duì)脂質(zhì)和DNA氧化損傷的影響。結(jié)果表明，對(duì)羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)和DNA氧化損傷，菊苣酸在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的抑制作用，但高濃度菊苣酸對(duì)二者的保護(hù)作用減弱或呈現(xiàn)促氧化作用。在烷氧自由基誘導(dǎo)體系中，菊苣酸對(duì)脂質(zhì)和DNA具有明顯保護(hù)作用，且菊苣酸濃度越高，保護(hù)效果越好。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與菊苣酸對(duì)小鼠組織蛋白氧化損傷的作用結(jié)果基本一致。