羅非魚皮膠原酶解物對HaCat細(xì)胞生長的影響

姜速峰，趙謀明，江虹銳,，劉小玲，白 洋

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西嘉盈生物科技有限公司，廣西 南寧 530000）

膠原是脊椎動(dòng)物中最豐富的蛋白質(zhì)，占脊椎動(dòng)物總蛋白質(zhì)的25%[1]。一些膠原肽已被證明具有很好的生物學(xué)活性，如美白[2]、抗氧化[3]、增加骨密度[4]和降低血壓[5]等，含膠原產(chǎn)品已被廣泛應(yīng)用于食品、制藥等多個(gè)行業(yè)[1]。近幾年來，我國羅非魚的產(chǎn)量穩(wěn)步增加，其加工魚片在水產(chǎn)品出口市場中占主要地位[6]，越來越多的研究關(guān)注于羅非魚皮、魚骨等副產(chǎn)物中膠原蛋白或肽的提取工藝及活性研究。莊永亮等[7]研究表明羅非魚皮經(jīng)中性酶與堿性酶法制備的膠原蛋白水解液有很強(qiáng)的羥自由基清除能力，并發(fā)現(xiàn)水解液中的抗氧化性肽段主要由甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸組成。Ngo[8]和Sun Liping[9]等也證實(shí)羅非魚膠原酶水解物具有很好的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基的能力。

膠原蛋白、膠原肽對皮膚損傷或生長也有促進(jìn)作用。Pati等[10]研究發(fā)現(xiàn)南亞野鯪魚鱗膠原蛋白制備的骨架對成纖維細(xì)胞具有很好的生長促進(jìn)作用；Tanaka[11]和Yaar[12]等的研究也發(fā)現(xiàn)羅非魚鱗膠原產(chǎn)品對治愈紫外誘導(dǎo)的皮膚損傷具有一定的有利作用；陳俊等[13]的研究發(fā)現(xiàn)羅非魚皮膠原酶解物和鯊魚皮酶解物具有可以替代谷胱甘肽在化妝品領(lǐng)域應(yīng)用的潛力，同時(shí)膠原酶解物通過分離純化之后有良好的促進(jìn)表皮細(xì)胞生長的能力。人永生化表皮細(xì)胞屬于成人表皮細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化而來的細(xì)胞系，它與人體正常的角質(zhì)形成細(xì)胞有相同的增殖、分化特性和遺傳穩(wěn)定性[14]，常被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為體外研究的細(xì)胞系，比如皮膚修復(fù)愈合和防曬等[15]研究。Zhao Xin[16]和Zhou Tian[17]等以人皮膚角質(zhì)HaCaT細(xì)胞作為研究對象，研究明膠、膠原對上皮細(xì)胞增殖分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞在明膠與膠原基質(zhì)上具有良好的生長能力，且能大量表達(dá)細(xì)胞增殖分化黏附相關(guān)因子。但是，關(guān)于羅非魚皮肽的抗氧化作用與促進(jìn)上皮角質(zhì)細(xì)胞的傷口愈合及生長相關(guān)性的研究很少報(bào)道。本研究利用下腳料羅非魚皮酶解物及膜分離組分，探討其體外抗氧化活性對人HaCat細(xì)胞生長和人上皮傷口愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮 廣西百洋食品有限公司；HaCaT細(xì)胞上海中喬新舟生物科技有限公司；中性酶、堿性酶、胃蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基 以色列BI公司；胰酶消化液、雙抗上海碧云天生物技術(shù)有限公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國BINDER公司；倒置顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；酶標(biāo)儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；超濾裝置 上海摩速科技有限公司；紫外-可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚皮膠原酶解物的制備

羅非魚皮經(jīng)脫色、脫脂、酸法[18]制備得膠原蛋白液，用堿性蛋白酶（alkaline enzyme，AE）、中性蛋白酶（neutral enzyme，NE）、胰蛋白酶（pancreatin enzyme，PE）分別對其酶解，相應(yīng)得到酶解物AEH、NEH和PEH。各酶解條件如下：2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）AE（1×106U/g），溫度55 ℃，pH 9.0；2.5% NE（2×105U/g），溫度55 ℃，pH 7.0；0.2% PE（4×103U/g），溫度50 ℃，pH 8.0；酶解時(shí)間1～180 min，所得酶解液經(jīng)沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥得到AEH、NEH和PEH，將各酶解物蛋白質(zhì)量濃度調(diào)為10、25、50、75、100、150 mg/mL備用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

羅非魚皮膠原蛋白酶解，每30 min測定各酶解物清除DPPH的能力，參考張玉等[19]的方法，取2 mL羅非魚皮酶解物于試管中，加入2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為Ai；取2 mL待測樣品于試管中，再加入2 mL無水乙醇，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為Aj；取2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液，加入2 mL無水乙醇，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為A0。根據(jù)式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.3 細(xì)胞增殖作用分析

采用MTT法[20]分析NEH、AEH、PEH對HaCat細(xì)胞生長的影響。在96 孔板中接種HaCat細(xì)胞的密度為3×103個(gè)/孔，總體積180 μL，6 h細(xì)胞貼壁后，各孔中加入10 μL質(zhì)量濃度分別為10、25、50、75、100、150 mg/mL的NEH、AEH、PEH，培養(yǎng)12、24、36、48 h。在檢測前4 h時(shí)每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）孵育，檢測前棄上清液，加入110 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處OD值，記為OD實(shí)驗(yàn)組。以不添加酶解物的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時(shí)間后得到的OD值為對照，記為OD對照組，根據(jù)式（2）計(jì)算細(xì)胞增殖率，繪制細(xì)胞增殖曲線。

式中：OD空白為含有不同質(zhì)量濃度酶解物培養(yǎng)基在490 nm波長處的OD值；OD零孔為細(xì)胞培養(yǎng)基在490 nm波長處的OD值。

1.3.4 膜分離

對NEH、AEH、PEH 3 種酶解物作用于HaCat細(xì)胞，檢測其細(xì)胞增殖作用與DPPH自由基清除能力，篩選具有最佳活性的酶解物進(jìn)行超濾膜分離，共分為＜1 ku、1～5 ku、5～10 ku、＞10 ku的4 個(gè)組分，并對該4 個(gè)組分進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，篩選出促細(xì)胞增殖活性最好的一個(gè)組分，經(jīng)真空冷凍干燥保存于－20 ℃。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

經(jīng)膜分離及MTT實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳膠原酶解物組分進(jìn)行HaCat細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，體外研究膠原酶解物對皮膚刮傷愈合作用的活性。參照文獻(xiàn)[21]，在96 孔板中接種細(xì)胞3×103個(gè)/孔，培養(yǎng)12 h后用10 μL槍頭在細(xì)胞表面劃出約5 mm的劃痕，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，去除損傷的細(xì)胞，加入含25 mg/mL膠原酶解物組分的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于0、12、24、36、48 h經(jīng)倒置顯微鏡拍照觀察，將不含膠原肽的無血清培養(yǎng)基作用組設(shè)為空白組，測量不同時(shí)間HaCaT細(xì)胞劃痕處傷口愈合距離，并按式（3）計(jì)算傷口愈合率。

式中：Lt為取樣時(shí)間點(diǎn)傷口的平均距離/mm；L0為0 h處的傷口平均距離/mm。

1.3.6 氨基酸組成測定

將膜分離后的膠原酶解物組分經(jīng)6 mol/L HCl溶液110 ℃消化22 h，除去鹽酸，經(jīng)超純水定容之后，0.22 μm濾膜過濾后，利用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測酶解物中的氨基酸組成。

1.3.7 凝膠色譜分析羅非魚皮膠原肽組分

參照文獻(xiàn)[22]，將作用于HaCaT細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)的肽樣品配成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后取2 mL過凝膠過濾分離層析系統(tǒng)，層析柱為Sephadex G-25（1.6 cm×40 cm）。用超純水洗脫樣品，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，洗脫液自動(dòng)部分收集，并對收集的液體測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析以及作圖采用SPSS 18.0和Origin 8.5軟件。對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力

圖1 TSCH清除DPPH自由基能力與酶解時(shí)間的關(guān)系Fig. 1 Scavenging effect of TSCH on DPPH free radical as a function of hydrolysis time

由圖1可以看出，羅非魚皮膠原酶解物對DPPH自由基的清除能力具有時(shí)間依賴性，隨著酶解時(shí)間的延長，NEH、AEH、PEH的DPPH自由基清除能力也升高，但酶解120～150 min后，各酶解物的DPPH自由基清除能力不再明顯升高。陳日春[23]研究酶解時(shí)間與酶解物清除DPPH自由基能力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶解到達(dá)一定程度，酶解物清除DPPH自由基的能力不再升高，與本研究結(jié)果一致。圖1中各酶解物清除DPPH自由基能力從高到低依次是：NEH＞AEH＞PEH，分別在酶解150、120、150 min時(shí)達(dá)到最大，在各酶解物清除DPPH自由基能力達(dá)到最大時(shí)，NEH與另外兩種酶解物有顯著性差異（P＜0.05），這與林金鶯[24]研究酶解種類與清除DPPH自由基能力之間的關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)的AEH清除DPPH自由基能力要高于NEH稍有不同，可能是由于酶解底物的氨基酸殘基序列與組成不同，經(jīng)過特異性酶解后，不同的特異性酶切位點(diǎn)會(huì)直接影響酶解產(chǎn)物中肽的分子質(zhì)量和氨基酸組成。此外，Kim等[25]的研究證實(shí)膠原酶解物的抗氧化活性與增強(qiáng)細(xì)胞活性之間有相關(guān)關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)膠原蛋白酶解時(shí)間與抗氧化活性的相關(guān)性，分別選擇酶解150 min的NEH、酶解120 min的AEH、酶解150 min的PEH為研究對象進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 細(xì)胞增殖作用分析

圖2 不同質(zhì)量濃度NEH（A）、AEH（B）、PEH（C）對HaCaT細(xì)胞的增殖作用Fig. 2 Effects of NEH (A), AEH (B) and PEH (C) on the growth stimulation of HaCaT cells at different concentrations and treatment periods

由圖2可知，NEH、AEH和PEH對HaCat細(xì)胞的增殖作用隨著作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，與Wang Yaowen等[26]報(bào)道絲裂霉素作用HaCaT細(xì)胞生長規(guī)律類似，同時(shí)也與Ohara等[27]研究Pro-Hyp二肽作用成纖維細(xì)胞生長作用規(guī)律相同，在細(xì)胞生長潛伏期，膠原肽對細(xì)胞生長不會(huì)產(chǎn)生明顯影響，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，膠原肽會(huì)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)由圖2可知，NEH、AEH和PEH促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)長為24 h，進(jìn)一步說明細(xì)胞在24 h之內(nèi)經(jīng)歷了從潛伏期到生長期的變化。

圖3 作用24 h后酶解物質(zhì)量濃度對HaCaT細(xì)胞的作用Fig. 3 Effects of enzymatic hydrolysates at different concentrations on the proliferation of HaCaT cells after 24 h

由圖3可知，隨NEH、AEH和PEH質(zhì)量濃度增加，促細(xì)胞增殖活性也呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這可能是低質(zhì)量濃度（5～20 mg/mL）酶解物對細(xì)胞無作用，而高質(zhì)量濃度酶解物導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓增大，破壞細(xì)胞原有穩(wěn)定的生存環(huán)境，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。這與Chung等[28]研究綠茶提取物對HaCaT細(xì)胞生長作用時(shí)，中、低質(zhì)量濃度提取物促進(jìn)細(xì)胞生長明顯，高質(zhì)量濃度反而會(huì)抑制細(xì)胞生長趨勢類似。此外，圖3中酶解物質(zhì)量濃度為10～150 mg/mL時(shí)，NEH、AEH和PEH促細(xì)胞增殖活性規(guī)律大致相似，作用效果依次為：NEH＞AEH＞PEH，75 mg/mL NEH對細(xì)胞的增殖活性最大，與AEH、PEH的最大增殖活性有顯著性差異（P＜0.05）。各酶解物MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈正相關(guān)，說明羅非魚皮膠原蛋白水解物的體外抗氧化活性與促進(jìn)細(xì)胞增殖能力之間可能有正相關(guān)關(guān)系。相比于另外兩種酶解物，NEH具有最高的細(xì)胞增殖活性與抗氧化活性。

圖4 膜分離NEH不同組分與質(zhì)量濃度對HaCaT細(xì)胞的作用Fig. 4 Effects of peptide fractions from NEH at different concentrations on HaCaT cells

如圖4所示，隨酶解物質(zhì)量濃度增加，膜截留得到的4 個(gè)組分的NEH對HaCaT細(xì)胞的增殖作用呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱趨勢，但其活性均高于未經(jīng)膜分離NEH，這說明超濾膜截留不同分子質(zhì)量的膠原肽酶解物富集了細(xì)胞增殖活性組分，1～5 ku組分促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最為突出，質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的增殖率達(dá)到（129.37±0.03）%，而＜1 ku、5～10 ku、＞10 ku的組分在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對細(xì)胞的增殖作用最大，其增殖率分別為（123.40±0.03）%、（122.84±0.02）%、（117.40±0.04）%，但其增殖作用顯著小于1～5 ku。結(jié)果說明1～5 ku組分表現(xiàn)出優(yōu)越的促HaCaT細(xì)胞增殖能力，陳日春[23]證實(shí)鰱魚魚鱗膠原肽分子質(zhì)量在1～5 ku的組分表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH能力，而Kim[29]和Mendis[30]等的研究也發(fā)現(xiàn)阿拉斯加鱈魚皮膠原酶解物的抗氧化活性與增強(qiáng)細(xì)胞活性之間有相關(guān)關(guān)系，即體外抗氧化活性越高，促進(jìn)細(xì)胞增殖作用表現(xiàn)得越大。因此，綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)研究，體外抗氧化活性與促進(jìn)細(xì)胞增殖之間呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證膜分離NEH獲得的1～5 ku組分的細(xì)胞活性，以下細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)選擇25 mg/mL進(jìn)行分析。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HaCaT細(xì)胞經(jīng)NEH（分子質(zhì)量1～5 ku）作用12、24、36、48 h的遷移狀況如圖5所示。

圖5 分子質(zhì)量1～5 ku膠原肽在不同時(shí)間對HaCaT細(xì)胞遷移的影響Fig. 5 Effects of collagen peptides on the migration of HaCaT cells at different treatment periods

研究細(xì)胞的遷移能力時(shí)，體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)茉诤艽蟪潭壬夏M體內(nèi)細(xì)胞生長遷移過程[31]。上皮細(xì)胞生長與增殖過程本質(zhì)是創(chuàng)傷愈合過程。圖5顯示，實(shí)驗(yàn)組和空白組HaCaT細(xì)胞在劃痕處傷口中的遷移速率與時(shí)間存在相關(guān)關(guān)系，即隨培養(yǎng)時(shí)間延長，劃痕處傷口間距離也相對應(yīng)縮短。

圖6 分子質(zhì)量1～5 ku膠原肽在不同時(shí)間對HaCaT細(xì)胞遷移中傷口愈合的影響Fig. 6 Effects of collagen peptides on the wound healing and migration of HaCaT cells at different treatment periods

圖6 顯示，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組劃痕處傷口愈合率（81.10±5.04）%與36 h傷口愈合率（81.22±5.77）%、48 h傷口愈合率（84.47±2.34）%劃痕處傷口愈合率已無顯著性差異（P＞0.05），這與之前膠原酶解物最佳作用HaCaT細(xì)胞時(shí)間24 h相符，而與12 h劃痕處傷口愈合率（54.62±6.88）%存在顯著性差異（P＜0.05），這說明添加膠原肽能使HaCat細(xì)胞劃痕處傷口24 h內(nèi)基本愈合完全。與實(shí)驗(yàn)組不同，未添加膠原肽的空白組，在培養(yǎng)時(shí)長36 h，劃痕處傷口愈合率（78.54±2.23）%與48 h劃痕處傷口愈合率（80.98±3.32）%無顯著性差異（P＞0.05），而與24 h劃痕處傷口愈合率（62.93±6.33）%存在顯著性差異（P＜0.05），這說明未加膠原肽的空白組HaCaT細(xì)胞劃痕處傷口需36 h基本愈合完全，比實(shí)驗(yàn)組劃痕處傷口愈合遲12 h。圖6同時(shí)還顯示，培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組劃痕處傷口愈合率（54.62±6.88）%與空白組劃痕處傷口愈合率（35.48±9.40）%有著極顯著性差異（P＜0.01），在24 h處也同樣如此。因此結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)制備的膠原肽對HaCaT細(xì)胞劃痕處實(shí)驗(yàn)傷口愈合有很大促進(jìn)作用。Haapasalmi等[32]報(bào)道，細(xì)胞表面有一種整合蛋白，在人和動(dòng)物的傷口處會(huì)大量分布，特別是含β1的整合蛋白會(huì)在傷口處高表達(dá)，整合素作為一種細(xì)胞外基質(zhì)的受體，與胞外配體結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞的生長。細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用會(huì)很大程度的控制細(xì)胞的生長[33]，因此，膠原肽能促進(jìn)傷口快速愈合，可能與這種調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

2.4 凝膠色譜分析

圖7 Sephadex G-25分離NEHFig. 7 Column chromatography separation of NEH on Sephadex G-25

如圖7所示，對分子質(zhì)量1～5 ku的NEH進(jìn)行凝膠層析分離，在220 nm波長處檢測，得到2 個(gè)洗脫峰，分別在12、23 min左右出峰，且在23 min時(shí)的吸光度最大。因此，1～5 ku組分對HaCaT細(xì)胞生長與劃痕處傷口愈合效果很可能與23 min分離的組分緊密相關(guān)，而這有待進(jìn)一步的研究。

2.5 氨基酸組成分析

以上實(shí)驗(yàn)表明膠原肽促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖很可能與其含有抗氧化氨基酸有關(guān)。由表1可知，膜分離NEH 4 個(gè)組分的甘氨酸與脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，這主要來源于羅非魚皮膠原中的Gly-X-Y結(jié)構(gòu)；因此，甘氨酸與脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高[18]。同時(shí)，表1中顯示1～5 ku的肽段中，苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著性高于其他3 種肽段（P＜0.05），膜分離NEH組分的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分子質(zhì)量在1～5 ku的肽段促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖效果最好，這可能與該肽中上述幾種氨基酸的高質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)。Liu Dasong等[34]的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸、脯氨酸以及亮氨酸出現(xiàn)在肽鏈C端，而組氨酸出現(xiàn)在N端時(shí)都表現(xiàn)出高效清除氧自由基活性，并且含酪氨酸的肽具有高的抗氧化活性，究其原因，酪氨酸具有酚基，作為氫供體終止自由基誘導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。同時(shí)林金鶯[24]的研究報(bào)道堿性氨基酸中的賴氨酸和精氨酸可與不飽和脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)生成鹽，從而抑制脂氧化，表現(xiàn)出好的抗氧化特性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)含組氨酸的肽一般都表現(xiàn)出高抗氧化活性。陳俊等[13]的研究表明，羅非魚皮膠原肽對HaCaT細(xì)胞生長和增殖有促進(jìn)作用，而主要原因是魚皮膠原肽具有高的抗氧化活性，通過增強(qiáng)細(xì)胞活性從而防止氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而其中起抗氧化關(guān)鍵作用的氨基酸是甘氨酸-酪氨酸。祝婧[35]證實(shí)魚膠原肽中苯丙氨酸和賴氨酸是影響成纖維細(xì)胞生長增殖的主要因素之一；李喜艷等[36]也報(bào)道賴氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用。因此，相比于膜分離NEH中的其他3 個(gè)組分，1～5 ku組分對細(xì)胞生長起到良好促進(jìn)作用，其抗氧化氨基酸亮氨酸（3.35%）、酪氨酸（1.49%）、苯丙氨酸（3.41%）、賴氨酸（4.50%）、組氨酸（1.17%）、精氨酸（10.51%）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他組分，對HaCaT細(xì)胞生長和傷口愈合起重要作用。由于氨基酸序列也會(huì)在一定程度上影響細(xì)胞活性，本研究中分子質(zhì)量1～5 ku組分含有兩組肽成分，其氨基酸組成對抗氧化活性及細(xì)胞增殖作用的影響有待進(jìn)一步研究。

表1 NEH各肽段的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table1 Amino acid composition of NEH%

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了羅非魚皮膠原酶解物對HaCaT細(xì)胞增殖的影響，并對膠原酶解物的抗氧化活性與促進(jìn)細(xì)胞生長之間關(guān)系進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，NEH有較高的體外抗氧化活性與促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖能力，膜分離NEH獲得的1～5 ku組分促進(jìn)HaCaT細(xì)胞生長最顯著，并能在24 h內(nèi)促進(jìn)HaCaT細(xì)胞劃痕處傷口愈合。經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，NEH（分子質(zhì)量1～5 ku）組分抗氧化氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于小于1 ku、5～10 ku和大于10 ku組分，羅非魚皮膠原肽促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長機(jī)制可能其抗氧化活性有關(guān)。