梵凈山藤茶黃酮含量分析及其復(fù)合飲料的加工工藝

謝勇，劉慶慶，盧忠英，姚元勇，高健強(qiáng)

（1.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁554300；2.貴州省梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁554300）

藤茶（Ampelopsis grossedentata），學(xué)名顯齒蛇葡萄，亦稱“白茶”等，屬葡萄科多年生木質(zhì)藤本植物，是我國(guó)特有的珍稀藥食兩用植物資源[1]。該物種在銅仁區(qū)域主要分布于武陵山脈主峰梵凈山南側(cè)的江口和石阡兩縣等地。研究表明，藤茶中可溶性蛋白質(zhì)約0.55%、氨基酸總量2.53%、非必需氨基酸總量1.8%，熱水浸提物中總黃酮含量19.3%～33.5%、其中二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）單體含量達(dá) 14%～30.6%，是藤茶的主要活性成分[2-4]。研究表明，DMY有抗氧化[5]、降低大鼠脫氧皮酮鹽性高血壓[6]、抑制小鼠血糖升高[7-8]、降低小鼠高脂血[9]及抗血栓[10]功效，金銀花（Lonicera japonica）中的綠原酸等有機(jī)酸有體外抗（adenosine aiphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集作用[11]、絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum Makino）具有明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間的作用[12]、且研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總皂苷具有抑制小鼠血小板血酸及靜脈血酸形成的作用[13-14]。丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）含有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等水溶性成分[15]，其中丹參素具有抗血小板聚集及抑制血小板二硫鍵異構(gòu)酶ERp57與整合素αⅡbβ的相互作用[16]。由此可知，金銀花、絞股藍(lán)及丹參均對(duì)血栓及其他心血管疾病有一定的防護(hù)功效。

功能性飲料主要包括運(yùn)動(dòng)飲料、營(yíng)養(yǎng)素飲料及其他特殊飲料3類。而中國(guó)功能性飲料主要以茶劑、沖劑及酒劑為主[16]。資料顯示，金銀花、絞股藍(lán)及丹參藥食兩用植物已被注冊(cè)為功能性飲料的原料，且已有35個(gè)以上以藥食兩用植物為配方的功能性飲料產(chǎn)品，其功效/標(biāo)志性成分以總皂苷、總黃酮及粗多糖居多，占總功效成分種類的83.87%[17]。目前，關(guān)于藤茶功能性飲料的研究較少，主要有藤茶一般性飲料[18]、藤茶復(fù)合飲料[19]，未有功能明確的藤茶功能性飲料研究報(bào)道。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，藤茶中的DMY在動(dòng)物體內(nèi)易消化，且代謝迅速[20]。

以藤茶、金銀花、絞股藍(lán)及丹參為主要原料，先分析梵凈山不同區(qū)域藤茶中黃酮的含量，再添加適量輔料以制備藤茶復(fù)合飲料，并考察各組分對(duì)飲料黃酮含量及感官品質(zhì)的影響，為藤茶功能性復(fù)合飲料的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

Alpha-1860A紫外可見分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；TP310酸度計(jì)：北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州普天儀器制造有限公司；NAI-ZFCDY-2Z脂肪測(cè)定儀：上海那艾精密儀器有限公司；SRH-S均質(zhì)機(jī)：上海世赫機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.2 主要材料與試劑

藤茶：貴州省銅仁學(xué)院藤茶種植基地（分別引種自梵凈山區(qū)域江口縣桃印鎮(zhèn)和德旺鎮(zhèn)、松桃縣寨英鎮(zhèn)）；金銀花、絞股藍(lán)及丹參：市售；二氫楊梅素（純度＞98%）：吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；果葡糖漿（食品級(jí)）：上海根菜食品有限公司；檸檬酸（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶復(fù)合飲料的制備

將采摘的新鮮藤茶殺青（100℃）15 min，40℃烘箱中干燥并粉碎，備用。稱取一定量的藤茶粉、金銀花、丹參、絞股藍(lán)，分別置于燒杯中并按100∶1（mL/g）的比例加入蒸餾水，于75℃水浴鍋中浸提40 min，抽濾除濾渣，按一定配比合并濾液，之后加入果葡糖漿等輔料，經(jīng)超聲脫氣（5 min）、均質(zhì)（5 min）、微波滅菌（3 min）、冷卻后灌裝，得成品。

1.3.2 藤茶復(fù)合飲料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

由具有食品專業(yè)背景的10人，從飲料的色澤、口感、氣味、組織狀態(tài)4個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 藤茶復(fù)合飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table1 Criteria for sensory evaluation of Ampelopsis grossedentata compound beverage

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)品DMY的濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL，先用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描以確定最大吸收波長(zhǎng)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和標(biāo)準(zhǔn)溶液的ODmax制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將干燥藤茶葉浸提液稀釋一定倍數(shù)后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，并計(jì)算藤茶中黃酮的含量；pH的測(cè)定：pH計(jì)直接測(cè)定；可溶性糖的測(cè)定：蒽酮-硫酸法[21]；粗蛋白含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]；粗脂肪含量的測(cè)定：國(guó)標(biāo)酸水解法[23]。

1.3.4 不同產(chǎn)地藤茶中黃酮含量（干重）的分析

分別采摘梵凈山3個(gè)不同區(qū)域的藤茶，第一次采摘時(shí)間為2016年4月16日（約發(fā)芽一周后），隨后每隔約一周采摘一次。將采摘后的新鮮藤茶葉按照1.3.1的方法進(jìn)行處理，干燥后稱取1 g，并按照1.3.3的方法測(cè)定總黃酮的含量。

1.3.5 不同組分對(duì)藤茶中黃酮含量的影響

為了探究飲料中不同組分對(duì)藤茶功能性成分黃酮含量的影響，于5支試管加入2 mL 0.002 mg/mL DMY標(biāo)品，再分別添加2 mL藤茶、金銀花、絞股藍(lán)及丹參的浸提液和蒸餾水，混合均勻后按照1.3.3的方法測(cè)定黃酮含量。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

以30mL藤茶汁為基準(zhǔn)，添加β-環(huán)糊精0.3mg/mL、食鹽0.5 mg/mL、VC0.02 mg/mL，考察不同因素對(duì)藤茶復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響：金銀花浸提液5、10、15、20、25mL，其它恒定條件為，絞股藍(lán)10 mL、丹參10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；絞股藍(lán)浸提液5、10、15、20、25 mL，其它恒定條件為，金銀 10 mL、丹參10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；丹參浸提液 5、10、15、20、25 mL，其它恒定條件為，金銀花10 mL、絞股藍(lán)10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；檸檬酸 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，其它恒定條件為，金銀花、絞股藍(lán)及丹參各10 mL，果葡糖漿0.08 g/mL；果葡糖漿 0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g/mL，其它恒定條件為，金銀花、絞股藍(lán)及丹參各10 mL，檸檬酸0.6 mg/mL。

1.3.7 藤茶復(fù)合飲料工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定丹參浸提液添加量10 mL，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化藤茶復(fù)合飲料的工藝配方，因素水平編碼如表2所示。

表2 藤茶復(fù)合飲料工藝優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table2 Factors and their levels of technology optimization experiments for Amplelopsis grossedentata compound beverage

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用“IBM SPSS 22.0”軟件和“Origin”軟件對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行處理，正交試驗(yàn)采用“正交設(shè)計(jì)助手V3.1”軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)測(cè)定，得DMY的最大吸收波長(zhǎng)λ為326 nm。黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=47.834X+0.006 4，R2=0.998 9，其中X為DMY的濃度（mg/mL），Y為OD326。

2.2 不同區(qū)域藤茶中黃酮含量的分析

在不同時(shí)期，測(cè)定了梵凈山不同區(qū)域藤茶（干重）的黃酮含量，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在藤茶發(fā)芽初期（4月16日左右），江口桃印藤茶黃酮含量最高，為（24.1±0.21）%，江口德旺的最低，為（21.1±0.25）%；隨著時(shí)間的增加，不同區(qū)域藤茶的黃酮含量均在增加，其中江口桃印藤茶的增幅平緩，江口德旺藤的增幅較大，到5月6日左右時(shí)，江口德旺藤茶黃酮的含量最高，為（40.3±0.53）%，江口桃印藤茶的含量最低，為（27.4±0.08）%。由此可知，梵凈山不同區(qū)域藤茶的黃酮含量在不同生長(zhǎng)時(shí)期是有差別的，且成熟期的差異最明顯。

圖1 梵凈山不同區(qū)域藤茶中總黃酮的含量Fig.1 Content of flavone of Amplelopsis grossedentata from different regions of Fanjing mountain

表3 不同組分對(duì)藤茶黃酮含量的影響Table3 Effect of different components on flavone content from Amplelopsis grossedentata

表4 不同組分添加量對(duì)藤茶飲料品質(zhì)的影響Table4 Effect of addition of Flos Lonicerae extraction on quality of Amplelopsis grossedentata beverage

2.3 不同組分對(duì)藤茶飲料中總黃酮含量的影響

考察了金銀花、絞股藍(lán)及丹參3種浸提組分對(duì)藤茶飲料黃酮含量的影響，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，3種不同組分不會(huì)降低藤茶中黃酮的含量，而是增加了飲料中黃酮的含量。原因可能是，3種組分中含有少量或微量黃酮類化合物；藤茶飲料中的各組分在加熱及均質(zhì)等條件下發(fā)生了絡(luò)合或包埋作用，使得總黃酮含量增加。而研究也表明，絞股藍(lán)、金銀花及丹參均含有黃酮、異黃酮及雙氫黃酮等黃酮類物質(zhì)[24-26]；梁曉慶等[27]測(cè)定得絞股藍(lán)中總蛋白含量為100 mg/mL～238 mg/mL，而這些蛋白質(zhì)在加熱條件下可通過自組裝的方式將藤茶中的黃酮進(jìn)行包埋，從而增強(qiáng)了黃酮的溶解度[28]。

2.4 不同組分對(duì)藤茶飲料品質(zhì)的影響

考察了金銀花浸提液、絞股藍(lán)浸提液及丹參浸提液對(duì)藤茶飲料感官品質(zhì)的影響，結(jié)果如表4所示。

當(dāng)金銀花汁添加量為20 mL時(shí)，感官評(píng)分最高，為85.2分；且金銀花和絞股藍(lán)對(duì)飲料的感官品質(zhì)有顯著影響。原因可能是金銀花中與金銀花氣味顯著相關(guān)的揮發(fā)性成分綠原酸、木犀草苷及多酚類增加了飲料的清香味[29]；金銀花中酚酸類、黃酮及環(huán)烯醚萜類物質(zhì)使其浸提液色澤鮮亮[30]；絞股藍(lán)具有飲后回甜的作用，適量添加可改善藤茶飲料的口感，但添加量過高，絞股藍(lán)的藥效成分總苷中的苦味皂苷含量高于甜味皂苷[31-32]，使得飲料口感苦澀，感官品質(zhì)變差。丹參對(duì)藤茶復(fù)合飲料的氣味有一定的影響，但對(duì)其他品質(zhì)的影響較?。≒=0.064）。

2.5 檸檬酸添加量對(duì)藤茶復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

考察了檸檬酸用量對(duì)藤茶復(fù)合飲料的品質(zhì)的影響，結(jié)果如表5所示。

表5 檸檬酸添加量對(duì)藤茶復(fù)合飲料品質(zhì)的影響Table5 Effect of citric acid addition on qualities of Amplelopsis grossedentata beverage

由表5可知，檸檬酸對(duì)藤茶復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響顯著。檸檬酸添加過量或不足均不利于飲料口感的改善。原因可解釋為，檸檬酸作為酸味劑，無揮發(fā)性、色澤白色，對(duì)飲料的氣味、色澤無明顯影響，但可與飲料中的葡萄糖、果糖及有機(jī)酸通過味的協(xié)同作用或拮抗作用，使飲料的酸味醇厚；另外，檸檬酸可結(jié)合金屬離子，防止金屬離子造成異味[3]。

2.6 果葡糖漿添加量對(duì)藤茶復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

考察了果葡糖漿對(duì)藤茶復(fù)合飲料品質(zhì)的影響，結(jié)果如表6所示。

表6 果葡糖漿添加量對(duì)藤茶復(fù)合飲料的影響Table6 Effect of fructose ayrup addition on qualities of Amplelopsis grossedentata beverage

由表6可知，果葡糖漿對(duì)藤茶復(fù)合飲料的品質(zhì)有顯著影響?？赡苁且?yàn)楣咸菨{是藤茶復(fù)合飲料甜味的最主要來源。果葡糖漿中果糖等甜味物質(zhì)與飲料中的有機(jī)酸等成分通過味的協(xié)同作用形成適宜的酸甜比，使飲料的口感細(xì)膩而醇厚。

2.7 藤茶復(fù)合飲料工藝優(yōu)化及結(jié)果

單因素試驗(yàn)方差分析如表7所示。

表7 單因素試驗(yàn)方差分析Table7 Variance analysis of single factor experiments

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，除丹參外其它幾個(gè)因素的影響均顯著。因此，選擇四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)絞股藍(lán)用量（A）、金銀花用量（B）、檸檬酸用量（C）及果葡糖漿用量（D）4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，因素水平如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

表8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table8 Design and results of orthogonal test

據(jù)表8得藤茶復(fù)合飲料最佳配方為A1B1C0D0，即藤茶30 mL，絞股藍(lán)20 mL，金銀花25 mL，檸檬酸0.06 mg/mL，果葡糖漿0.08 g/mL。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分為（88.5±0.5）分，結(jié)合正交試驗(yàn)數(shù)值，可知此配方最優(yōu)，效果最好。所得到藤茶復(fù)合飲料色澤棕黃、氣味清香、組織透明、酸甜適中、口感細(xì)膩、無懸浮物、無異味，具有藤茶復(fù)合飲料特有的風(fēng)味。

2.8 理化指標(biāo)

經(jīng)測(cè)定，藤茶復(fù)合飲料中黃酮含量0.15 g/mL、pH值為5.6、可溶性糖含量為0.092 g/mL、粗蛋白含量為0.67mg/mL、粗脂肪未檢出。

3 結(jié)論

1）梵凈山不同區(qū)域藤茶中黃酮含量（干重）在藤茶不同生長(zhǎng)時(shí)期存在差異，江口德旺最高，為（40.3±0.53）%，且丹參、金銀花及絞股藍(lán)均可增加藤茶復(fù)合飲料中黃酮的含量。

2）藤茶復(fù)合飲料的最佳配方為：30 mL藤茶、20 mL絞股藍(lán)、25 mL金銀花、10 mL丹參、0.06 mg/mL檸檬酸、0.08 g/mL果葡糖漿、0.5 mg/mL食用鹽、0.02 mg/mL VC、β-環(huán)糊精0.3 mg/mL，此條件下感官評(píng)分最高，為（88.5±0.5）分。

3）藤茶復(fù)合飲料中總黃酮含量為0.15 g/mL，pH值5.6，可溶性糖含量為0.092 g/mL，粗蛋白含量為0.67 mg/mL，粗脂肪未檢出。所得藤茶復(fù)合飲料呈棕褐色、氣味清香、組織透明、酸甜適中、口感細(xì)膩、無懸浮物、無異味，具有藤茶復(fù)合飲料特有的風(fēng)味。