參芪扶正注射液調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白7改善紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥

李 磊

(新汶礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院藥學(xué)部，新泰 271233)

肺癌臨床高發(fā)，我國肺癌發(fā)病率逐年上升，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的75%～80%[1]。非小細(xì)胞肺癌目前的首選治療方法是手術(shù)，但對于局部晚期不適合手術(shù)的患者及術(shù)后治療，化療仍是主要手段。

紫杉醇和吉西他濱是臨床非小細(xì)胞肺癌治療的主要藥物，但臨床多藥耐藥問題嚴(yán)重影響了兩藥在臨床的有效使用[2-3]。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜，多種因素均可導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的發(fā)生，其中腫瘤細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白的高表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤藥物耐藥的最主要原因[4]。多藥耐藥相關(guān)蛋白7(MRP7)是多藥耐藥相關(guān)蛋白家族中的一種，其對紫杉烷類和長春花生物堿類藥物具有細(xì)胞外排作用[5-6]。研究表明，在使用過紫杉醇(peclitaxel) 或長春瑞濱并產(chǎn)生耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中MRP7具有高表達(dá)[6]。此外，采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)研究證明，在吉西他濱耐藥的非小細(xì)胞肺癌中MRP7的基因表達(dá)也明顯增高，基因組學(xué)研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中MRP7的基因高表達(dá)是預(yù)測吉西他濱耐藥的重要指標(biāo)[7-8]。

參芪扶正注射液是我國傳統(tǒng)扶正補(bǔ)氣藥物，主要成分是黨參和黃芪，具有益氣扶正、益肺健脾的功效[9-10]。近年臨床將參芪扶正注射液用于非小細(xì)胞肺癌的輔助治療，療效明顯。研究表明，參芪扶正注射液配合紫杉醇在治療非小細(xì)胞肺癌中可提高化療療效、減輕化療毒性；配合吉西他濱化療治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌，能減輕化療的毒性和不良反應(yīng)[11-14]，并通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[15]。研究發(fā)現(xiàn)，參芪扶正注射液可通過調(diào)節(jié)多藥耐藥基因(multidrug resistanct，MDR1)和肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)的蛋白表達(dá)，改善非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥[16]。但參芪扶正注射液與紫杉醇和吉西他濱聯(lián)用提高療效的作用機(jī)制還有待研究。因此，本研究將建立紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株，考察參芪扶正注射液對紫杉醇和吉西他濱在非小細(xì)胞肺癌耐藥方面的改善作用及其機(jī)制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 HF-90型二氧化碳培養(yǎng)箱(中國力康生物科技公司)；Tecan Mpro200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；BSC-ⅡA2生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣有限公司)。

1.2試藥 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，購自GIBCO公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽和MTT，購自Sigma公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%；紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號325022)，吉西他濱(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，批號BIFK0023)，均購自北京百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈均為分析純(美國Fisher公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞的建立 采用逐步增加藥物濃度的方法，持續(xù)刺激A549細(xì)胞，分別建立紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞，取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，分別加入紫杉醇和吉西他濱使其作用濃度為1和3 nmol·L-1的低濃度持續(xù)作用于A549細(xì)胞，保證A549細(xì)胞在該藥物濃度下穩(wěn)定生長、傳代；待細(xì)胞適應(yīng)紫杉醇和吉西他濱并可穩(wěn)定增殖時(shí)，增加紫杉醇和吉西他濱的作用濃度(3和5 nmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)，維持藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度下穩(wěn)定生長、傳代；2個(gè)月后獲得穩(wěn)定的紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株[17]。

2.2MTT法檢測紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞存活率 將紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞以2×104個(gè)·孔-1接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育24 h，后加入不同濃度的紫杉醇和吉西他濱并設(shè)置空白對照，每孔總體積為200 μL，孵育24 h后吸出培養(yǎng)基，每孔200 μL，各濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h，用于MTT檢測；每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去MTT液；每孔加入200 μL DMSO，振蕩15 min，使DMSO充分溶解，在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值。

2.3MTT法檢測參芪扶正注射液聯(lián)合紫杉醇和吉西他濱對耐藥A549細(xì)胞存活率的影響 將紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞以2×104個(gè)·孔-1接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育24 h后，加入含有不同劑量的參芪扶正注射液的培養(yǎng)基及紫杉醇和吉西他濱并設(shè)置空白對照，每孔總體積為200 μL，孵育24 h后吸出培養(yǎng)基，每孔200 μL，各濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用于MTT檢測；每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，繼續(xù)孵育4 h后，吸去MTT液；每孔加入200 μL DMSO，振蕩15 min，使DMSO充分溶解，在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，以對照組吸光度值為對照，計(jì)算細(xì)胞相對存活率。

2.4胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的濃度檢測 將A549細(xì)胞及耐藥A549細(xì)胞以5×106個(gè)·孔-1接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h，在含有10 nmol·L-1紫杉醇和20 nmol·L-1吉西他濱的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，用冷PBS緩沖液沖洗2次，以2 700 r·min-1離心5 min，然后用高效液相色譜儀測定細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量(濃度用測定每5×106個(gè)細(xì)胞中的紫杉醇和吉西他濱含量表示)。另外，測定聯(lián)合給予參芪扶正注射液后，細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量。紫杉醇色譜條件為：色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相比例為水∶甲醇∶乙腈=25∶40∶35；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm[18-19]。吉西他濱檢測條件：色譜柱Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；炔諾酮為內(nèi)標(biāo)；流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水=40∶30∶30；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：227 nm；柱溫：40 ℃[20]。

2.5Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中的MRP7 對數(shù)生長期的A549耐藥細(xì)胞(4×105個(gè)·mL-1)接種于6孔板中，其中每板設(shè)1孔陰性對照，其余4孔細(xì)胞貼壁后加入終濃度為60 mL·L-1的參芪扶正注射液，培養(yǎng)24 h后裂解、收集進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的分離膠中電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，2 h后蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜中，后將濾膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶中封閉1.5 h，加入MRP7一抗過夜(1∶500)，再加入二抗(羊抗鼠辣根過氧化物酶)2 h，在室溫條件下孵育60 min。采用ECL顯色曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)掃面分析，同時(shí)檢測GAPDH 蛋白作為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞對紫杉醇和吉西他濱的敏感度明顯降低 通過MTT實(shí)驗(yàn)證明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞模型，低劑量紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)建立的A549耐藥細(xì)胞株在同等紫杉醇和吉西他濱給藥劑量下(紫杉醇：1.25，2.5，5，10，20和40 nmol·L-1，吉西他濱：6.25，12.5，25，50，75和100 nmol·L-1)，對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制率相對于正常A549細(xì)胞顯著降低，說明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞造模成功，見圖1。

3.2紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量明顯降低 采用HPLC法檢測A549細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。A549耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的濃度顯著降低，給予10 nmol·L-1的紫杉醇或25 nmol·L-1的吉西他濱后，正常A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞中含有紫杉醇18.2±1.85和3.11±0.74 ng；A549耐藥細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量分別為4.38±0.47和0.74±0.17 ng。耐藥細(xì)胞中紫杉醇及吉西他濱含量相對于正常A549細(xì)胞差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。

圖1非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及耐藥細(xì)胞抑制率

A.正常A549細(xì)胞與紫杉醇耐藥細(xì)胞抑制率；B.正常A549細(xì)胞與吉西他濱耐藥細(xì)胞抑制率。(n=3)。

Fig.1 The inhibition rate of normal cells and drug resistance cells

A.the inhibition rate of normal A549 cells and paclitaxel drug resistance cells；B.the inhibition rate of normal A549 cells and gemcitabine drug resistance cells.(n=3).

圖2細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量

A.正常細(xì)胞與紫杉醇耐藥細(xì)胞；B.正常細(xì)胞與吉西他濱耐藥細(xì)胞。*P<0.05，n=5。

Fig.2 The content of paclitaxel and gemcitabine in cells

A.normal cells and paclitaxel resistance cells；B.normal cells and gemcitabine resistance cells.*P<0.05，n=5.

3.3參芪扶正注射液明顯提高紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞敏感性 在含有不同劑量的(5，15，30和60 mL·L-1)的參芪扶正注射液的培養(yǎng)基中，加入紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，參芪扶正注射液對耐藥細(xì)胞無明顯抑制作用。將含有60 mL·L-1的參芪扶正注射液的培養(yǎng)液與不同濃度紫杉醇5 nmol·L-1(a)和20 nmol·L-1(b)單獨(dú)與聯(lián)合作用于A549紫杉醇耐藥細(xì)胞后，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。紫杉醇20 nmol·L-1組，細(xì)胞存活率為73.3%±7.5%，而參芪扶正注射液與等劑量紫杉醇聯(lián)用后，細(xì)胞存活率為52.7%±6.4%，與單一組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將含有60 mL·L-1的參芪扶正注射液的培養(yǎng)液與不同濃度吉西他濱單獨(dú)與聯(lián)合使用后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。吉西他濱20 nmol·L-1(a)和45 nmol·L-1(b)單一組細(xì)胞存活率分別為92.3%±4.5%和87.3%±4.6%，而等劑量吉西他濱與參芪扶正注射液聯(lián)用后，細(xì)胞存活率分別為80.6%±6.4%和74.7%±4.4%，與單一吉西他濱組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3參芪扶正注射液對A549耐藥細(xì)胞抑制率

A.紫杉醇耐藥A549細(xì)胞；B.吉西他濱耐藥A549細(xì)胞(n=5)。

Fig.3 The inhibitory rate of Shenqi Fuzheng Injections on resistant A549 cells

A.paclitaxel resistant A549 cells；B.gemcitabine resistant A549 cells (n=5).

圖4參芪扶正注射液提高紫杉醇在紫杉醇耐藥A549細(xì)胞中的敏感性

注：*P<0.05 vs紫杉醇20 nmol·L-1，n=5。

Fig.4 Shenqi Fuzheng Injections improved the sensitivity of paclitaxel in paclitaxel-resistant A549 cells

Note:*P<0.05 vs paclitaxel 20 nmol·L-1，n=5.

圖5參芪扶正注射液提高吉西他濱在吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中的敏感性

注：*P<0.05，n=5。

Fig.5 Shenqi Fuzheng Injections improved the sensitivity of gemcitabine in gemcitabine-resistant A549 cells

Note:*P<0.05，n=5.

3.4參芪扶正注射液明顯增加紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱濃度 檢測細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱含量，結(jié)果顯示，紫杉醇和吉西他濱與參芪扶正注射液聯(lián)合使用后，紫杉醇耐藥A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有紫杉醇7.20±1.27 ng，吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有吉西他濱1.5±0.41 ng；與單一給藥組比較，每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)分別含有紫杉醇和吉西他濱4.38±0.47和0.74±0.17 ng，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，見圖6。

圖6參芪扶正注射液提高紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量

注：*P<0.05 vs單一給藥，n=5。

Fig.6 Shenqi Fuzheng Injections enhanced the content of paclitaxel and gemcitabine in paclitaxel or gemcitabine-resistant A549 cells.

Note:*P<0.05 vs single drug，n=5.

3.5參芪扶正注射液明顯抑制紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞中的MRP7表達(dá) Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)的A549耐藥細(xì)胞中MRP7明顯升高，但給予參芪扶正注射液可顯著降低耐藥細(xì)胞中MRP7表達(dá)，見圖7。

圖7參芪扶正注射液對紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)的A549耐藥細(xì)胞中MRP7的影響

注：與正常A549細(xì)胞比較，**P<0.01；與耐藥A549細(xì)胞比較，*P<0.05，n=3。

Fig.7 The effect of Shenqi Fuzheng Injections on MRP7 in paclitaxel or gemcitabine-induced multidrug resistance A549 cells

Note:compared with normal A549 cells，**P<0.01；compared with drug resistant A549 cells，*P<0.05，n=3.

4 討論

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是臨床腫瘤治療面臨的重要問題，紫杉醇和吉西他濱是臨床非小細(xì)胞肺癌治療的主要用藥，而耐藥是導(dǎo)致紫杉醇和吉西他濱臨床治療失敗的主要原因。近期研究發(fā)現(xiàn)，MRP7在紫杉醇和吉西他濱等非鉑類腫瘤藥物的耐藥中具有重要作用，可減少腫瘤細(xì)胞中腫瘤藥物濃度和腫瘤藥物細(xì)胞毒性作用。本研究通過建立非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞株，表明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞對紫杉醇和吉西他濱敏感性顯著降低，其中MRP7蛋白表達(dá)升高，通過HPLC法檢測胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量，結(jié)果表明，2種腫瘤藥物在細(xì)胞中的含量顯著降低；但將參芪扶正注射液與紫杉醇和吉西他濱聯(lián)合給藥后，在紫杉醇和吉西他濱耐藥劑量下，可提高該劑量下對細(xì)胞增殖的抑制作用；提高細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱含量，降低耐藥細(xì)胞中MRP7的表達(dá)。

化療在非小細(xì)胞肺癌NSCLC的治療中至關(guān)重要，而多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。MRP7是新近發(fā)現(xiàn)的ATP結(jié)合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter,ABC)家族C族成員，報(bào)道顯示，ABC家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)體在MDR中起主要作用，MRP7通過外排功能導(dǎo)致化療藥物從腫瘤細(xì)胞中向外排出細(xì)胞，導(dǎo)致化療藥物靶濃度減少，療效降低。早期研究發(fā)現(xiàn)，MRP7在紫衫醇耐藥中發(fā)揮著重要作用，但在吉西他濱的耐藥中存在爭議，近期研究發(fā)現(xiàn)，采用MRP7抑制劑千金藤素作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可明顯提高吉西他濱的療效[7]，此外基因組學(xué)研究表明，MRP7的高表達(dá)在吉西他濱腫瘤耐藥中是重要預(yù)測指標(biāo)[8]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參芪扶正注射液對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞MRP7具有一定的抑制作用，可提高腫瘤細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量。因此，參芪扶正注射液提高腫瘤患者的化療效果與抑制MRP7具有一定的關(guān)系。而紫杉醇和吉西他濱腫瘤耐藥的作用機(jī)制復(fù)雜，與多藥耐藥蛋白家族及P-糖蛋白、微管蛋白和熱休克蛋白基因等均有關(guān)系[21-22]，因此針對參芪扶正注射液對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。