新基因FAM172A對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

趙貝， 常祺， 錢凱， 劉文俊， 林春明， 劉灝

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血管外科, 廣東 廣州 510000)

動脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因，是伴有內(nèi)皮細胞凋亡的慢性炎癥性疾病，而且內(nèi)皮功能障礙在動脈粥樣硬化的發(fā)生、進展和臨床進程中具有早期和允許作用[1].內(nèi)皮位于血管的最內(nèi)層，能夠“感知”血液動力和血液信號的變化，并通過釋放一些生物活性因子“回應”變化.內(nèi)皮細胞的增殖、凋亡、功能變化破壞了這些活性因子之間的平衡，從而使血管壁易受血管炎，白細胞黏附，血小板活化，促氧化，血栓形成和凝血功能受損的影響，導致動脈粥樣硬化[2-3].內(nèi)皮細胞的增殖抑制及凋亡的增加促進動脈粥樣硬化、血管形成術(shù)后再狹窄、斑塊的形成、血管栓塞的發(fā)生發(fā)展，從而導致大血管并發(fā)癥的發(fā)生.基因FAM172A，即序列相似性家族172，也稱為C5orf21，由李連喜等[4]在2009年發(fā)現(xiàn)，并首次從人動脈組織中克隆出來.隨后李連喜團隊又在人主動脈內(nèi)皮細胞、人主動脈平滑肌細胞和THP-1巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了FAM172A蛋白的表達，并且證明了高葡萄糖、油酸及LDL均能上調(diào)巨噬細胞中FAM172A的表達，其中高糖能以濃度、時間依賴的方式增加人主動脈平滑肌細胞中FAM172A的表達[4-5].但是，F(xiàn)AM172A對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的功能還沒有具體的研究.此外，從其他多個領(lǐng)域的研究結(jié)果中，可知FAM172A能夠調(diào)控細胞生長[6-11].本研究采用構(gòu)建真核基因表達載體以及合成靶向干擾RNA的方法，增加或者干擾FAM172A的表達，初步探索了新基因FAM172A對HUVEC增殖和凋亡的影響.在探索FAM172A對HUVEC影響機制時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65的表達與FAM172A的表達呈正相關(guān)，因此推測新基因FAM172A調(diào)控HUVEC的增殖和凋亡是通過NF-κB通路實現(xiàn)的.

1 材料和方法

1.1 實驗細胞和試劑

HUVEC來自于第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內(nèi)科實驗室；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；質(zhì)量分數(shù)為0.25% Trypsin-EDTA的胰酶購自Gibco公司；青鏈霉素混合液、感受態(tài)細菌E.coli DH5α、質(zhì)粒小提試劑盒、氨芐青霉素、蛋白胨、瓊脂粉、Western及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自Solarbio公司；真核表達空白質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)及重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A為本課題組前期構(gòu)建；酵母提取物購自O(shè)XOID公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000、Trizol試劑 購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本東洋紡公司；SYBR實時熒光定量PCR試劑盒購自DBI公司；PCR引物合成來自上海生物工程有限公司；FAM172A-siRNA、陰性對照siRNA(NC)以及綠色熒光(FAM)標記的NC序列由蘇州吉瑪有限公司合成；硝酸纖維素膜購自美國Pall公司；小鼠源多克隆FAM172A抗體為本課題組前期合成；小鼠源NF-κBp65單克隆抗體購自CST公司；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自proteintech公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠二抗購自中杉金橋；CCK-8細胞增殖試劑盒購自日本同仁；細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司.

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建、擴增及鑒定

真核表達空白質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)及重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A為本課題組前期構(gòu)建.將構(gòu)建的pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A分別轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，挑選陽性單克隆，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，送至北京華大基因公司進行測序分析.

1.3 siRNA序列的設(shè)計與合成

根據(jù)提供的FAM172A基因編號 transcript variant 1(NM_032042.5)由蘇州吉瑪有限公司設(shè)計合成.提供針對FAM172基因設(shè)計4條siRNA序列(FAM172A-siRNA777、919、1017、1162)，1條與已知的人類基因無同源性的陰性對照序列siRNA-NC,1條綠色熒光(FAM)標記的NC序列.

FAM172A-siRNA777上下游引物分別為5′-GAUAUGGAGUAAUAGUACUTT-3′、5′-AGUACU-AUUACUCCAUAUCTT-3′;

FAM172A-siRNA919上下游引物分別為5′-GAAGCGACGUGAUUUCUAUTT-3′、5′-AUAGAA-AUCACGUCGCUUCTT-3′;

FAM172A-siRNA1017上下游引物分別為5′-CAAUCUAUGUUUGGGAUCATT-3′、5′-UGAUCC-CAAACAUAGAUUGTT-3′;

FAM172A-siRNA1162上下游引物分別為5′-GACAGACUCUGUUCACAAUTT-3′、5′-AUUGUGA-ACAGAGUCUGUCTT-3′;

siRNA-NC上下游引物分別為5′-UUCUCCG-AACGUGUCACGUTT-3′、5′-ACGUGACACGUUCG-GAGAATT-3′;

FAM標記的NC上下游引物分別為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、5′-ACGUGAC-ACGUUCGGAGAATT-3′.

1.4 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

將HUVEC接種于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含質(zhì)量分數(shù)10%的滅活胎牛血清，1%的青鏈霉素混合液)，置于37℃，體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng).質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗分為轉(zhuǎn)染試劑組(只加了脂質(zhì)體3000組)、空白質(zhì)粒組(pcDNA3.1/myc-His(-))、重組質(zhì)粒組(pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A)，轉(zhuǎn)染之前1 d，將2～4×105/孔HUVEC接種至已加入1.5 mL不含抗生素的培養(yǎng)基的6孔板中，每組3個復孔，置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天，細胞融合達70%～90%左右轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，4 μg/孔.干擾RNA轉(zhuǎn)染實驗分為轉(zhuǎn)染試劑組(只加了脂質(zhì)體3000組)、陰性對照組(siRNA-NC)、FAM172A-siRNA777組(si777組)、FAM172A-siRNA919組(si919組)、FAM172A-siRNA1017組(si1017組)、FAM172A-siRNA1162組(si1162組)，轉(zhuǎn)染之前1 d，將1.5～2×105/孔HUVEC接種至已加入1.5 mL不含抗生素的培養(yǎng)基的6孔板中，置于37 ℃,體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天，細胞融合達30%～50%左右轉(zhuǎn)染siRNA，濃度至100 nmol/L.

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及siRNA轉(zhuǎn)染效果檢測

1.5.1 各組細胞FAM172A mRNA的表達

采用實時熒光定量的方法.pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC后，于24 h收集細胞，siRNA-NC、FAM172A-siRNA777、FAM172A-siRNA919、FAM172A-siRNA1017、FAM172A-siRNA1162轉(zhuǎn)染HUVEC后，于48 h收集細胞，利用Trizol試劑盒提取RNA，并于核酸分析儀上檢測所得RNA濃度，并利用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈.逆轉(zhuǎn)錄反應體系為10 μL，在37 ℃條件下進行15 min的逆轉(zhuǎn)錄反應，在98 ℃條件下進行5 min的酶失活反應，然后迅速置于冰上.利用SYBR Green I染料法檢測細胞FAM172A基因的相對表達量.以β-action作為內(nèi)參照，對每個樣本分別進行FAM172A、NF-κBp65、β-action基因檢測.FAM172A上游引物5′-CAACGAGAAGCCGATGTA-3′，下游引物5′-CAACGAGAAGCCGATGTA-3′；NF-κBp65上游引物5′-AGCACGACAACATCTCATT-3′，下游引物5′-GGCACAACTCCTTCATCC-3′；β-action上游引物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′.總反應體系體積為20 μL.反應條件：95 ℃ 2 min 變性后，進行40個循環(huán)擴增，每個循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s和72 ℃ 30 s.隨后，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min, 55～98 ℃ (10 s/cycle, 0.5 ℃/cycle) 86 cycles獲得溶解曲線.各基因的表達公式為:

F=2-ΔΔCT，ΔΔCT=(待測組目的基因CT-待測組內(nèi)參基因CT)-(對照組組目的基因CT值-對照組內(nèi)參基因CT值)，計算FAM172A、NF-κBp65的相對表達.

1.5.2 各組細胞FAM172A蛋白的表達

采用Western Blot的方法檢測干預后的HUVEC中FAM172A的表達.pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC后，于48 h收集細胞，siRNA-NC、FAM172A-siRNA777、FAM172A-siRNA919、FAM172A-siRNA1017、FAM172A-siRNA1162轉(zhuǎn)染HUVEC后，于72 h收集細胞并提取總蛋白，以只加轉(zhuǎn)染試劑組為對照組.配置質(zhì)量分數(shù)為10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白的裂解液上樣，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入鼠源多克隆FAM172A抗體(1∶500稀釋)、鼠源NF-κBp65抗體(1∶600)或鼠源GAPDH抗體(1∶6 000稀釋)，4 ℃過夜.加入山羊抗鼠二抗(1∶6 000稀釋)，37 ℃孵育2 h；ECL化學發(fā)光顯色，ImageJ軟件分析目的條帶相對吸光度值，各組數(shù)據(jù)均使用相應的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)進行標準化處理，最終結(jié)果為實驗組與對照組相對吸光度的比值.

1.6 細胞增殖率檢測

(1)采用CCK-8法 將HUVEC細胞以8 000/孔接種至96孔板，按上述方法將質(zhì)粒DNA pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC，質(zhì)粒DNA 0.2 μg/孔(或者將HUVEC細胞以5 000/孔接種至96孔板，按上述方法轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-FAM172A-1162轉(zhuǎn)染至96孔板中，濃度至100 nmol/L)，分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h，每孔加10 μL的CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在多功能酶標儀(Thermo MULTISKAN MK3)450 nm波長處測A450值，以A450間接反映細胞存活數(shù)量.每組3個復孔，以只加脂質(zhì)體組為對照組，無細胞組為空白組，結(jié)果按照以下公式計算：細胞增殖=A450實驗組(對照組)-A450空白組.

(2)EdU細胞增殖檢測法 將HUVEC細胞以60 000/孔接種于24孔板，按上述方法將質(zhì)粒DNA pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC，質(zhì)粒DNA 0.2 μg/孔(或者將HUVEC細胞以40 000/孔接種至24孔板，按上述方法轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-FAM172A-1162轉(zhuǎn)染至24孔板中，siRNA濃度為100 nmol/L)，轉(zhuǎn)染48 h后使用EdU 細胞增殖試劑盒對細胞進行DNA及細胞核染色，然后于熒光顯微鏡下觀察并拍照：

細胞增殖率=紅色核染數(shù)/藍色核染數(shù)×100%.

1.7 細胞凋亡檢測

流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡.按照以上方式將HUVEC接種至6孔板，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h，siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，流式管收集細胞，PBS洗兩遍，加入300 μL 1×BindingBuffer重懸細胞，每管加入5 μL的Annexin V-FITC，染色15 min，上機前每管加入5 μL的PI染液，上機檢測后，使用FACSDiva Version 6.1.3軟件分析實驗結(jié)果.

1.8 各組細胞中NF-κBp65的表達

收集上述轉(zhuǎn)染各組細胞，提取總RNA，RT-qPCR檢測各轉(zhuǎn)染組NF-κBp65的mRNA的表達；收集細胞，提取總蛋白，Western Blot 檢測NF-κBp65的蛋白的表達.

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效果檢測

2.1.1 各組細胞FAM172AmRNA表達的比較

HUVEC轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A24 h后，轉(zhuǎn)染試劑組FAM172A的表達為1.001±0.063，空白質(zhì)粒的表達為1.021±0.034，重組質(zhì)粒的表達為36.966±2.866(表1、圖1).HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC、FAM172A-siRNA777、FAM172A-siRNA919、FAM172A-siRNA1017、FAM172A-siRNA1162 48 h后,轉(zhuǎn)染試劑組的表達為1.002±0.090，siRNA-NC組的表達為1.047±0.069，siRNA777組的表達為0.489±0.022，siRNA919組的表達為0.398±0.024，siRNA1017組的表達為0.353±0.017，siRNA1162組的表達為0.317±0.024(表2、圖2).由此可知FAM172A-siRNA1162干擾效率最高，可降低68.3%.

表1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后，各組FAM172AmRNA的表達

組別2-ΔΔCTVehicle1.001±0.063pcDNA3.1/myc-His(-)1.047±0.694pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A33.966±2.860

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后實時熒光定量PCR檢測FAM172A基因的表達

Fig.1 The gene expression ofFAM172Awere tested by Quantitative Real-time PCR after transfection with the plasmid

表2轉(zhuǎn)染siRNA后，各組FAM172AmRNA的表達

組別2-ΔΔCTMock1.003±0.090siRNA-NC1.047±0.069siRNA-777 0.489±0.022siRNA-9190.398±0.024siRNA-1017 0.353±0.017siRNA-11620.317±0.024

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后實時熒光定量PCR檢測FAM172A基因的表達

Fig.2 The gene expression ofFAM172Awere tested by Quantitative Real-time PCR after transfection with the siRNA

2.1.2 各組細胞FAM172A蛋白的表達

HUVEC轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A48 h后，轉(zhuǎn)染試劑組的表達為1.012±0.028,空白質(zhì)粒組的表達為1.038±0.033，重組質(zhì)粒的表達為 2.772±0.010 (表3、圖3).HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA1162 72 h后，轉(zhuǎn)染試劑組的表達為1.000±0.014,siRNA-NC組的表達為0.095±0.023，siRNA1162組的表達為 0.262±0.025(圖4、表4).

表3轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后，各組FAM172A蛋白的表達

組別相對光密度vehicle1.012±0.028pcDNA3.1/myc-His(-)1.038±0.033pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A2.772±0.010

2.2 各組HUVEC細胞增值率比較

2.2.1 CCK-8實驗

pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC 后，連續(xù)3d檢測細胞在波長450 nm處的吸光度(圖5).0 h后，轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為0.811±0.083，空白質(zhì)粒組細胞吸光度為0.749±0.034，重組質(zhì)粒細胞吸光度為0.743±0.034 5，3組無統(tǒng)計學差異；轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.229±0.032，空白質(zhì)粒組細胞吸光度為1.226±0.039，重組質(zhì)粒組細胞吸光度為0.995±0.035，3組有統(tǒng)計學差異；HUVEC轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.446±0.056，空白質(zhì)粒組細胞吸光度為1.412±0.052，重組質(zhì)粒組細胞吸光度為1.242±0.160，3組有統(tǒng)計學差異；HUVEC轉(zhuǎn)染72 h后轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.864±0.019，空白質(zhì)粒組細胞吸光度為1.897±0.033，重組質(zhì)粒細胞增值率為1.646±0.024，3組有統(tǒng)計學差異(表5)；siRNA-NC、FAM172A-siRNA1162轉(zhuǎn)染HUVEC后，連續(xù)3 d檢測細胞在波長450 nm處的吸光度(圖6). 0 h后，轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為0.758±0.016，siRNA-NC組細胞吸光度為0.780±0.072，siRNA1162組細胞吸光度為0.757±0.31，3組無統(tǒng)計學差異；轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.082±0.007，siRNA-NC細胞吸光度為1.070±0.007，siRNA1162組細胞吸光度為1.137±0.015，3組有統(tǒng)計學差異；轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.601±0.036，siRNA-NC細胞吸光度為1.578±0.034，siRNA1162組細胞吸光度為1.874±0.153，3組有統(tǒng)計學差異；轉(zhuǎn)染HUVEC 72 h后轉(zhuǎn)染試劑組細胞吸光度為1.894±0.023，siRNA-NC組細胞吸光度為1.838±0.010，siRNA1162組細胞吸光度為2.127±0.070，3組有統(tǒng)計學差異(表6).綜上可知，基因FAM172A能夠抑制HUVEC的增殖.

圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后蛋白免疫印跡檢測FAM172A基因的表達

Fig.3 The gene expression ofFAM172Awere tested by western blotting after transfection with the plasmid

圖4 轉(zhuǎn)染靶向干擾FAM172A的siRNA后蛋白免疫印跡檢測FAM172A蛋白水平

Fig.4 The gene expression of FAM172A were tested by western blotting after transfection with the siRNA targeting FAM172A

表4轉(zhuǎn)染siRNA后，各組FAM172A蛋白的表達

組別相對光密度mock 1.000±0.014siRNA-NC 0.995±0.023siRNA-1162 0.262±0.025

圖5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后CCK-8細胞增殖實驗檢測HUVEC的增殖

Fig.5 The proliferation of HUVEC was detected after transfection with the plasmid by CCK-8 assay

圖6 轉(zhuǎn)染siRNA后CCK-8細胞增殖實驗檢測HUVEC的增殖

Fig.6 The proliferation of HUVEC was detected after transfection with the siRNA by CCK-8 assay

組別A(0 h)A(24 h)A(48 h)A(72 h)Vehicle0.811±0.0831.229±0.0321.446±0.0561.864±0.019pcDNA3.1/myc-His(-)0.749±0.0341.226±0.0401.412±0.0521.897±0.033pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM1720.733±0.0360.995±0.035 1.242±0.0161.646±0.024

組別A(0 h)A(24 h)A(48 h)A(72 h)mock0.758±0.0161.082±0.0071.601±0.0361.894±0.023siRNA-NC0.780±0.0721.070±0.0071.578±0.0341.838±0.010siRNA11620.757±0.0311.137±0.0151.874±0.1532.127±0.070

2.2.2 EdU實驗

pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A、pcDNA3.1/myc-His(-)siRNA-NC、FAM172A-siRNA1162轉(zhuǎn)染細胞48 h后，EdU細胞增殖實驗重組質(zhì)粒組細胞增值率為(19.5±0.8)%，空白質(zhì)粒組細胞增值率為(23.4±1.1)%，兩組有統(tǒng)計學差異；干擾對照組增值率為(25.3±1.0)%，干擾組細胞增值率為(30.6±0.96)%，兩組有統(tǒng)計學差異 (表7、圖7).

表7轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA及siRNAEdU細胞增殖實驗檢測HUVEC增殖

Table7TheproliferationofHUVECwasmeasuredaftertransfectionwiththeplasmidandsiRNAbyEdUassay

組別細胞增值率/%pcDNA3.1/myc-His(-)23.4±1.1pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A19.5±0.8siRNA-NC25.3±1.0SiRNA116230.6±1.0

圖7 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NDA及干擾RNA后EdU細胞增殖實驗檢測HUVEC增殖

2.3 各組HUVEC細胞凋亡比較

pcDNA3.1/myc-His(-)、pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A轉(zhuǎn)染HUVEC 24 h后，檢測兩組細胞凋亡率，即Annexin V陽性率，Q2+Q4的總和.空白質(zhì)粒組細胞凋亡率為(4.0±0.7)%，重組質(zhì)粒組細胞凋亡率為(5.8±0.7)%；siRNA-NC、FAM172A-siRNA1162轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，檢測兩組細胞凋亡率.siRNA-NC細胞凋亡率為(4.3±0.2)%；siRNA1162細胞凋亡率為(2.4±0.1)%(表8).綜上可知基因FAM172A促進HUVEC的凋亡(圖8、圖9).

表8轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA及siRNA細胞后，流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡

Table 8 The apoptosis of HUVEC was measured after transfection with the plasmid and siRNA by flow cytometry %

Fig.8 The apoptosis of HUVEC was detected by flow cytometry

2.4 各組細胞中NF-κBp65的基因表達

收集上述轉(zhuǎn)染各組細胞，RT-qPCR、Western Blot 檢測各轉(zhuǎn)染組NF-κBp65的mRNA及蛋白的表達.RT-qPCR檢測結(jié)果重組質(zhì)粒組NF-κBp65mRNA表達比空白質(zhì)粒組高(1.327±0.037、0.978±0.020，P<0.05，表9、圖10)，干擾FAM172A組NF-κBp65mRNA表達比陰性對照組低(0.166±0.008、0.980±0.020，P<0.05，表10、圖11)；Western blot 結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組NF-κBp65蛋白表達比空白質(zhì)粒組高(2.034±0.018、1.050±0.044，P<0.05，表11、圖12)，干擾FAM172A組NF-κBp65蛋白表達比陰性對照組低(0.366±0.006、0.996±0.006，P<0.05，表12、圖13).

圖9 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及siRNA后流式細胞技術(shù)檢測HUVEC凋亡

組別2-ΔΔCTVehicle1.001±0.063pcDNA3.1/myc-His(-)0.978±0.020pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A1.327±0.037

表10轉(zhuǎn)染FAM172A靶向siRNA后，各組NF-κBp65mRNA的基因表達

組別2-ΔΔCTMock1.000±0.026siRNA-NC 0.980±0.020siRNA-11620.166±0.008

圖10 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后熒光定量PCR檢測NF-κBp65mRNA的基因表達

Fig.10 The gene expression ofNF-κBp65mRNAwere detected by Quantitative Real-time PCR after transfection with the plasmid

圖11 轉(zhuǎn)染siRNA后實時熒光定量PCR檢測NF-κBp65mRNA基因的表達

Fig.11 The gene expression ofNF-κBp65mRNAwere detected by Quantitative Real-time PCR after transfection with the siRNA

表11轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后，各組NF-κBp65蛋白的表達

組別相對光密度vehicle1.000±0.034pcDNA3.1/myc-His(-)1.050±0.044pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A2.034±0.018

圖12 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后蛋白免疫印跡檢測NF-κBp65蛋白的表達

Fig.12 The gene expression of NF-κBp65 protein was detected by western blotting after transfection with the plasmid

表12轉(zhuǎn)染FAM172A靶向siRNA后，各組NF-κBp65蛋白的表達

組別相對光密度mock1.000±0.018siRNA-NC0.996±0.006siRNA-11620.366±0.006

圖13 轉(zhuǎn)染FAM172A靶向siRNA后蛋白免疫印跡檢測NF-κBp65基因的表達

Fig.13 The gene expression of NF-κBp65 protein was detected by western blotting after transfection with the siRNA targetingFAM172A

3 討論

本研究采用構(gòu)建真核基因表達載體以及合成靶向干擾RNA的方法，增加或者干擾FAM172A的表達，初步檢測了FAM172A對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響.從實驗結(jié)果可知FAM172A能夠抑制HUVEC的增殖，促進HUVEC的凋亡.內(nèi)皮位于血液和組織的分界面，正常的內(nèi)皮細胞除起機械屏障作用和信息傳遞外，還可通過合成、分泌血管活性物質(zhì)而調(diào)節(jié)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，如保持血管收縮及舒張平衡、抑制SMC增生和遷移、保持血栓形成和纖溶蛋白溶解平衡以及信息傳遞等.血管內(nèi)皮細胞的增殖在許多心血管疾病病理生理過程都起著十分重要的作用[12-13].高脂血癥、高血壓、糖尿病及感染等均可直接或間接作用于血管內(nèi)皮細胞，引起內(nèi)皮細胞分泌功能失調(diào)，發(fā)生一系列反應，如脂質(zhì)浸潤、單核細胞黏附等，此過程中內(nèi)皮細胞損傷是關(guān)鍵因素.受損內(nèi)皮由鄰近的成熟內(nèi)皮細胞通過分裂增生來填補.研究表明，內(nèi)皮細胞的增殖在動脈粥樣硬化血管損傷后修復、破裂斑塊的穩(wěn)定中起重要作用.因此，從某種程度上說，F(xiàn)AM172A可能抑制了血管內(nèi)皮的修復，影響了血管損傷修復.

在探索FAM172A調(diào)控HUVEC細胞增殖和凋亡機制時，發(fā)現(xiàn)NF-κBp65與FAM172A表達呈正相關(guān).NF-κp65是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，在不同的組織細胞中的不同刺激條件下，NF-κp65激活可通過調(diào)節(jié)多種不同靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥、免疫以及細胞生長凋亡等多種病理生理過程[14-16].大量文獻報道NF-κB在調(diào)節(jié)多種細胞增殖、凋亡過程中具有重要作用.但不同的研究者在NF-κB信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)對不同細胞、不同刺激條件下NF-κB的激活對細胞增殖凋亡的影響并不一致.而FAM172A調(diào)控HUVEC細胞增殖和凋亡的方式可能涉及NF-κB信號通路.李梅芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)FAM172A可以通過p38蛋白信號傳導途徑的活化促進甲狀腺乳頭狀瘤細胞增殖，也有研究發(fā)現(xiàn)FAM172至少部分通過Notch 3信號傳導抑制肝癌細胞周期和細胞增殖[8]，表明FAM172A可能通過多個信號通路調(diào)控細胞生長.動脈粥樣硬化是全球死亡的主要原因，是一種慢性炎癥性疾病，通常在動脈粥樣硬化形成的起始階段，炎癥發(fā)生在血管的最內(nèi)層血管內(nèi)皮.發(fā)炎的內(nèi)皮細胞釋放促炎介質(zhì)，如促炎癥細胞因子，趨化因子和黏附分子[17-18].而這些促炎癥趨化因子的產(chǎn)生由轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導，NF-κB是內(nèi)皮炎癥過程中激活的炎性相關(guān)信號通路[19-20].因此，F(xiàn)AM172A可能參與NF-κB介導的炎癥反應影響HUVEC的增殖與凋亡.當然，為了驗證是否正確，必須進行進一步實驗.