HPLC法測定益心通脈顆粒中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量

王艷偉，代雪平，王曉偉

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450018)

益心通脈顆粒處方由黃芪、人參、北沙參、玄參、丹參、川芎、郁金和炙甘草8味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的功效，主治氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)所致的胸痹，癥見胸悶心痛、心悸氣短、倦怠汗出和咽喉干燥及冠心病心絞痛見上述證候者[1]。丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰的功效，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，為方中主藥。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版一部，采用HPLC法測定丹參酮ⅡA的含量。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，我們發(fā)現(xiàn)該含量測定方法，不能準(zhǔn)確測出丹參酮ⅡA的含量。因丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA是丹參中活性較強(qiáng)、含量較高的有效成分[2-9]，為了提高標(biāo)準(zhǔn)的可操作性，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和提高，研究建立了同時(shí)測定益心通脈顆粒中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量測定方法，為全面控制益心通脈顆粒的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260 DAD檢測器(美國安捷倫科技有限公司)；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XPE205電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 丹參酮Ⅰ對(duì)照品(批號(hào)110867-201607)、隱丹參酮對(duì)照品(批號(hào)110852-200806)和丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)110766-201520)，均購自中國食品藥品檢定研究院；益心通脈顆粒(河南輔仁堂制藥有限公司提供，批號(hào)：20161201，20170102，20170305，20170601，20170602)；甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Luna 5 μm C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(67∶33)；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃。理論塔板數(shù)按照丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[10-13]。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 取丹參酮Ⅰ對(duì)照品、隱丹參酮對(duì)照品和丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一棕色量瓶中，加甲醇制成丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為 42.0，35.8和31.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品，研細(xì)，精密稱取5 g，置于棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[14-15]。

2.2.3陰性樣品溶液 按照益心通脈顆粒處方比例和工藝制備缺丹參的陰性樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 按照2.1項(xiàng)下色譜條件，取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣測定。供試品色譜中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA與其相鄰色譜峰均能達(dá)到良好的分離，陰性樣品無干擾。見圖1。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液1，2，5，8，10，15，20和30 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定。以峰面積y對(duì)進(jìn)樣量x進(jìn)行線性回歸，得丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的線性回歸方程分別為：y=2 562.4x+7.530 7，r=1.000；y=4 566x-9.765 2，r=1.000；y=5 281.9x-10.746，r=1.000。結(jié)果表明，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA進(jìn)樣量分別在0.042～1.260，0.036～1.073和0.032～0.948 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，結(jié)果丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為0.2%，0.2%和0.2%，表明儀器精密度良好。

圖1HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.丹參酮Ⅰ；2.隱丹參酮；3.丹參酮ⅡA。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.samples；C.negative control samples；1.tanshinone Ⅰ；2.cryptotanshinone；3.tanshinone ⅡA.

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取益心通脈顆粒(批號(hào)20161201)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣分析。結(jié)果丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為1.1%，0.2%和0.2%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取益心通脈顆粒(批號(hào)20161201)6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算其中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量。結(jié)果丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.099 4，0.139 5和0.142 4 mg·g-1，其RSD值分別為0.5%，0.7%和0.6%。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的益心通脈顆粒(批號(hào)20161201，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA含量分別為0.099 4，0.139 5和0.142 4 mg·g-1)6份，每份2.5 g，精密加入混合對(duì)照品溶液(丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為16.87，22.32和 20.22 μg·mL-1)25 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of recovery test of tanshinone Ⅰ,cryptotanshinone and tanshinone ⅡA

成分取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%丹參酮Ⅰ2.500 20.248 50.421 80.657 897.0397.41.22.500 90.248 60.421 80.654 096.112.501 20.248 60.421 80.658 897.252.502 20.248 70.421 80.662 298.032.501 00.248 60.421 80.667 699.342.500 50.248 50.421 80.654 996.34隱丹參酮2.500 20.348 80.558 00.897 698.3699.51.62.500 90.348 90.558 00.900 998.932.501 20.348 90.558 00.905 799.782.502 20.349 10.558 00.910 0100.532.501 00.348 90.558 00.904 1102.042.500 50.348 80.558 00.918 297.65丹參酮ⅡA2.500 20.356 00.505 50.844 296.5797.60.82.500 90.356 10.505 50.851 297.942.501 20.356 20.505 50.848 297.342.502 20.356 30.505 50.849 597.562.501 00.356 10.505 50.846 797.052.500 50.356 10.505 50.855 798.84

2.9樣品含量測定 按照2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液制備方法和2.1項(xiàng)下色譜條件，測定5批益心通脈顆粒中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果見表2。

表2樣品中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA含量測定結(jié)果

Tab.2 Determination results of tanshinone Ⅰ，cryptotanshinone and tanshinone ⅡA in samples(mg·g-1)

生產(chǎn)批號(hào)丹參酮Ⅰ含量隱丹參酮含量丹參酮ⅡA含量201612010.099 40.139 50.142 4201701020.210 20.241 30.333 4201703050.183 00.185 80.271 5201706010.174 40.260 70.362 4201706020.135 10.196 70.279 9

3 討論

3.1提取方法的選擇 以甲醇為提取溶劑，分別超聲、加熱回流1 h制備供試品溶液，測定樣品中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果回流提取的含量較高，故選擇回流提取[16-17]。

3.2提取溶劑的選擇 分別以體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、甲醇和二氯甲烷-甲醇(1∶1)為提取溶劑，加熱回流1 h制備供試品溶液，測定樣品中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果使用甲醇提取含量最高，故選擇甲醇提取[18-20]。

3.3提取時(shí)間的選擇 以甲醇為提取溶劑，分別加熱回流30，60和90 min制備供試品溶液，測定樣品中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果回流提取60 min后含量不再增加，故選擇回流提取60 min。

4 結(jié)論

《中國藥典》2015年版一部益心通脈顆粒含量測定項(xiàng)下采用二氯甲烷-甲醇(1∶1)混合溶液作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)研究表明，采用甲醇作為提取溶劑與采用二氯甲烷-甲醇(1∶1)混合溶液作為提取溶劑測得樣品中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量差異較大，采用甲醇為提取溶劑能更準(zhǔn)確地測定3種成分的含量。樣品的含量測定結(jié)果表明，不同批次的產(chǎn)品3種成分含量差異較大，反映廠家需要關(guān)注不同批次產(chǎn)品之間的穩(wěn)定性。新建立的含量測定方法優(yōu)化了供試品溶液的制備方法，同時(shí)測定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA等多個(gè)有效成分，有利于控制益心通脈顆粒的穩(wěn)定性，保證藥品的有效性。