miR-581對結(jié)直腸癌細胞增殖與侵襲的影響及機制

張紅，馮繼紅，丁婷婷，泮紅飛，羅軍敏

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高[1]。超過三分之一的結(jié)直腸癌患者最終會發(fā)展成遠處轉(zhuǎn)移[2]。miRNA是一類小的非編碼RNA，含有約22個核苷酸[3]。 miRNA能部分結(jié)合3′UTR的特定靶mRNA，導致mRNA降解或抑制翻譯[4]。miRNA在細胞增殖、發(fā)育和分化等生物學進程中起重要作用[5]，且多種類型的miRNA可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞行為[6]。miR-581是一類新近發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，最近研究顯示，miR-581在肝癌組織中的表達低于癌旁組織[7]，但對于其在其他組織中的研究目前鮮見報道。我們在前期基礎(chǔ)實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-581在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達明顯低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織。2013年6月～2017年6月，我們探究miR-581對結(jié)直腸癌細胞生物學的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO和人正常結(jié)直腸細胞FHC，購于上海中科院，L-15培養(yǎng)基、McCoy′s 5 A、RPMI1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶購于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)和雙抗購于美國?？寺」?；PBS磷酸鹽緩沖液購于BOSTER。miR-581 mimics和pcDNA3.1-過氧化物氧化還原酶蛋白1(PRDX1)購于上海吉瑪有限公司。氯仿、乙醇、異丙醇購于重慶川東化工公司。TRIzol裂解液、Premix ExTaq Version2.0和SYBR Premix Ex Taq購于日本Takara 公司。PCR 引物由上海Sangon Biotech公司合成。CCK-8試劑盒購于日本DOJINDO公司。Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司；Transwell小室購于美國康寧公司。GAPDH小鼠抗人一抗、β-actin小鼠抗人一抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Western blotting凝膠試劑盒和全蛋白提取試劑盒購于碧云天公司；ECL發(fā)光液購于索萊寶生物科技有限公司。SW620、LOVO、FHC細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的L-15培養(yǎng)基中，HT29細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中，均于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進行傳代，以下實驗均取處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2 細胞分組及處理 PBS緩沖液將細胞清洗干凈，胰酶消化細胞2 min，轉(zhuǎn)移至無菌15 mL離心管，離心并計數(shù)細胞，以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達70%左右時進行轉(zhuǎn)染。將細胞分為實驗組(加入miR-581 mimics)和對照組(加入vector)；無血清培養(yǎng)基將Lipofectamine2000按3 μL/L進行稀釋，37 ℃孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基分別將miR-581 mimics和pcDNA3.1- PRDX1按50 μmol/L稀釋，常溫下孵育5 min，最后與Lipofectamine2000等體積分別混勻，分別加入兩組細胞中，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)；12 h后，觀察轉(zhuǎn)染細胞狀態(tài)，并將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，提取細胞RNA，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.3 不同結(jié)直腸細胞株中miR-581表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。按照說明書提取人正常結(jié)直腸細胞FHC和人結(jié)直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO中的總microRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，利用熒光PCR儀檢測相應(yīng)cDNA中miR-581的相對表達量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，45個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為60 ℃。采用2-ΔΔCt方法計算，重復3次。普通cDNA qRT-PCR檢測以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法進行統(tǒng)計，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。選擇miR-581表達最低的細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 結(jié)直腸癌細胞SW620增殖能力檢測 采用CCK-8實驗分別檢測miR-581 mimics組和對照組細胞增殖能力。消化并計數(shù)結(jié)直腸癌SW620細胞，以5 000個/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，每組3個復孔，37 ℃孵箱培養(yǎng)；待細胞貼壁，觀察細胞狀態(tài)，吸出培養(yǎng)基，避光條件下，將CCK-8試劑和完全培養(yǎng)基按1∶10比例混勻，分別加入每孔細胞中，37 ℃孵育1 h；將miR-581 mimics和mimics vector 分別轉(zhuǎn)染入SW620細胞，48 h后收集細胞,酶標儀檢測490 nm波長處每孔細胞的吸光度值，并統(tǒng)計分析。

1.5 結(jié)直腸癌細胞SW620侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲試驗。將5×104個SW620細胞置于上室，并加入Matrigel基質(zhì)膠(BD Bioscience，Woburn，MA，USA)。將具有10%FBS和HGF(20 ng/mL)的培養(yǎng)基置于下室中。37 ℃孵育24 h，小心去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈，于倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.6 熒光素酶報告基因測定 構(gòu)建含 PRDX1 基因野生型 3′UTR(含 miR-581 識別位點/wt)、突變型 3′UTR(miR-581 識別位點點突變/mut)片段，兩端均設(shè)計 XbaⅠ酶切位點，插入熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL3-promoter，Promega)構(gòu)建 pGL3-3′UTR wt、pGL3-3′UTR mut。取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞，將PRDX1與miR-581共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h據(jù)Promega公司操作說明，裂解細胞，加入熒光素酶底物，檢測熒光素酶活性，驗證miR-581能否與PRDX1 3′UTR結(jié)合，證明miR-581是否能直接調(diào)控PRDX1。

1.7 SW620細胞中PRDX1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。根據(jù)PRDX1蛋白相對分子質(zhì)量大小，配制凝膠，根據(jù)所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μL的蛋白Marker；跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加至120 V；切膠，根據(jù)所需條帶大小，對照蛋白Marker進行切膠，并準備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉中封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4 ℃過夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

1.8 SW620細胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的增殖能力檢測 將SW620細胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組，前者轉(zhuǎn)染miR-581 mimics，后者將miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同方法1.2，待轉(zhuǎn)染48 h后，消化細胞，同方法1.4通過CCK-8檢測細胞增殖能力。

1.9 SW620細胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的侵襲能力檢測 將SW620細胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PROX1組，前者轉(zhuǎn)染miR-581 mimics，后者miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同方法1.2，待轉(zhuǎn)染48 h后，消化細胞，同方法1.5通過Transwell檢測細胞侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1 miR-581在不同結(jié)直腸癌細胞株中的表達比較 miR-581在人正常結(jié)直腸細胞FHC和人結(jié)直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO的相對表達量分別為1.02±0.13、0.50±0.12、0.47±0.21、0.65±0.09，miR-581在SW620細胞中的表達低于其他結(jié)直腸癌細胞株(P均<0.05)。

2.2 miR-581對結(jié)直腸癌細胞SW620增殖能力的影響 miR-581 mimics組、對照組中miR-581相對表達量分別為8.81±0.42、1.25±0.37,P<0.05。miR-581 mimics組細胞增殖能力弱于對照組(P<0.05)。

圖1 miR-581對SW620細胞增殖能力的影響

2.3 miR-581 對結(jié)直腸癌細胞SW620侵襲能力的影響 對照組通過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)量為(174.5±12.8)個/HP，miR-581 mimics組為(87.1±11.4)個/HP，兩組比較，P<0.05。

2.4 雙熒光素酶報告基因結(jié)果 野生型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，顯著降低相對熒光素酶活性(1.04±0.12 vs 1.53±0.03，P<0.05)，而突變型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，熒光素酶活性無明顯改變(1.64±0.04 vs 1.59±0.06，P>0.05)。miR-581能與PRDX1 3′UTR特異性結(jié)合。

2.5 miR-581對結(jié)直腸癌細胞SW620中PRDX1蛋白表達的影響 對照組、PRDX1組、miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組PRDX1蛋白相對表達量分別為1.15±0.34、2.87±0.28、0.40±0.09、1.95±0.37，四組間兩兩比較，P均<0.05。

2.6 PRDX1逆轉(zhuǎn)miR-581 對結(jié)直腸癌細胞SW620增殖能力的影響 第5天，miR-581+PRDX1組細胞增殖能力較miR-581 mimics組強，見圖2。

圖2 PRDX1干預(yù)后miR-581 對結(jié)直腸癌細胞

2.7 PRDX1逆轉(zhuǎn)miR-581 對結(jié)直腸癌細胞SW620侵襲能力的影響 SW620細胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的侵襲能力，較單獨轉(zhuǎn)染miR-581 mimics更強，但弱于單獨轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒的SW620細胞，細胞穿膜數(shù)分別為259.2±23.3、94.2±17.1、202.1±27.5，P<0.05。

3 討論

多種在腫瘤中異常表達的miRNAs分子，在腫瘤進展過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[8]，miRNAs可靶向調(diào)控多種基因參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學過程，與各種臨床腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)合前期試驗基礎(chǔ)微陣列實驗及實時熒光定量檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-581在結(jié)直腸癌組織中的表達低于癌旁組織，且在轉(zhuǎn)移性癌組織中表達明顯降低，因此，我們推測miR-581在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

為進一步驗證miR-581是否在結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，我們首先通過轉(zhuǎn)染miR-581 mimics上調(diào)SW620細胞中miR-581的表達，CCK-8實驗證實細胞增殖能力減弱，同時，Transwell侵襲實驗顯示miR-581能降低其侵襲能力。說明miR-581可能是潛在的抑癌基因，但miR-581在結(jié)直腸癌中的作用機制尚需進一步深入研究。

氧化應(yīng)激在多種癌癥的發(fā)病機制中起重要作用。主要是由于活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生導致DNA的結(jié)構(gòu)損傷，如插入、缺失、堿基對突變或重排[10]。另外，ROS可直接激活細胞核與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導通路[11]。過氧化物毒素(PRDX)是具有復雜寡聚體的蛋白質(zhì)家族結(jié)構(gòu)的一類巰基過氧化物酶，哺乳動物有六種不同的PRDX ，各種類型的PRDX具有多種甚至相反的功能[12]。已證明PRDX1在乳腺癌[13]、惡性間皮瘤[14]和肺癌[15]組織中過度表達。此外，PRDX1與致癌基因的產(chǎn)物c-Abl和c-Myc相互作用，從而抑制c-Abl激酶活性[16]和c-Myc介導的轉(zhuǎn)化作用[17]。

而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PRDX1可促進人結(jié)腸癌SW480細胞EMT的發(fā)生，從而增強結(jié)腸癌 SW480 細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[18]。我們通過Targetscan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)PRDX1與miR-581具有相似的結(jié)合位點，兩者可能有內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)。故我們選擇雙熒光素酶實驗驗證miR-581和PRDX1的相關(guān)作用關(guān)系。結(jié)果與我們的猜測一致，野生型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，熒光素酶活性顯著降低，而突變型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，熒光素酶活性無明顯改變。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PRDX1的過表達顯著逆轉(zhuǎn)了miR-581對SW620細胞中增殖和侵襲的抑制作用。因此，PRDX1是miR-581的直接靶標，并且參與miR-581對結(jié)直腸癌細胞調(diào)控的影響。

綜上所述，miR-581可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲，其機制可能與靶向調(diào)控PRDX1有關(guān)。