高效液相色譜法測(cè)定芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷與毛蕊花糖苷的含量

閆 瑤， 孟新源， 許歡歡， 楊建華， 胡君萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054； 2附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830000； 3藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

芪蓉潤(rùn)腸口服液是由黃芪(炙)、肉蓯蓉、白術(shù)、太子參、地黃、玄參、麥冬、當(dāng)歸、黃精(制)等15味中藥材加工而成，臨床上多用于氣陰兩虛、脾腎不足、大腸失于濡潤(rùn)而致的虛癥便秘[1]。芪蓉潤(rùn)腸口服液成分中的肉蓯蓉具有提高結(jié)腸收縮幅度、加強(qiáng)腸道收縮力、糾正胃腸激素水平等作用，對(duì)脾腎陽(yáng)虛型便秘效果顯著[2]。肉蓯蓉的主要活性成分是苯乙醇苷，松果菊苷和毛蕊花糖苷是苯乙醇苷中的指標(biāo)性成分[3-4]。有研究表明[5-7]，松果菊苷可能通過(guò)增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1來(lái)促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞MODE-K細(xì)胞的增殖和細(xì)胞存活率，從而修復(fù)腸道上皮細(xì)胞，促進(jìn)小腸推進(jìn)力，引起排便時(shí)間縮短；毛蕊花糖苷則具有增強(qiáng)免疫、抗自由基和防止脂質(zhì)過(guò)氧化等作用。本研究采用HPLC法，同時(shí)考察芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，以期為該藥品的質(zhì)量控制提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(Waters科技有限公司)，Waters 2487型紫外檢測(cè)器(Waters科技有限公司)，Empower色譜工作站(Waters科技有限公司)，Sartorius BP211D型電子天平(瑞士METTLER公司)，UV2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，基因研究型超純水機(jī)FJY1002-UVF(青島富勒姆科技有限公司)。

1.2試藥甲醇(美國(guó)Fisher 公司，批號(hào)145629，色譜純)，磷酸(天津市富宇精細(xì)化工材料有限公司，批號(hào)20141020)，乙腈(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20121207，分析純)。松果菊苷對(duì)照品與毛蕊花糖苷對(duì)照品為本課題組從鹽生肉蓯蓉Cistanchesalsa中分離制備，UV，IR，EI-MS，1H-NMR，13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相符，含量經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定純度大于95%。

1.3藥品芪蓉潤(rùn)腸口服液(北京北衛(wèi)藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：120534、141042、141232、150538)。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品和松果菊苷對(duì)照品適量于10 mL容量瓶，用80%甲醇溶解并定容至刻度，制備成毛蕊花糖苷對(duì)照品濃度為224 μg/mL和松果菊苷對(duì)照品濃度為513 μg/mL的混合溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備取芪蓉潤(rùn)腸口服液每個(gè)批號(hào)各3份，12 000 r/min離心20 min，去沉淀部分，取上清液0.5 mL于10mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件采用HypersilODS-2色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.4%磷酸水溶液，B為乙睛，梯度條件為0～5 min 83% A-17% B；5～20 min 80% A-20% B；20～25 min 80% A-20% B；25～30 min 83% A-17% B，流速為1.00 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為333 nm，進(jìn)樣量為20 μL見(jiàn)圖1、2。

圖1 混合對(duì)照品HPLC色譜圖 (1 松果菊苷；2毛蕊花糖苷)

圖2 供試品HPLC色譜圖 (1 松果菊苷；2毛蕊花糖苷)

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.4.1 松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mL，用80%甲醇定容至5 mL容量瓶，制成系列混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得松果菊苷線性回歸方程Y=13 600X+35 137，r=0.999 5，松果菊苷濃度在12.83～205.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μL，用80%甲醇定容至5 mL容量瓶，制成系列混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得毛蕊花糖苷的線性回歸方程Y=25 431X-12 768，r=0.999 3，毛蕊花糖苷濃度在0.56～8.96 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn)吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定3次，測(cè)得松果菊苷峰面積的RSD為1.4%、毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.7%，表明方法精密度良好。

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批芪蓉潤(rùn)腸口服液(批號(hào)為150538)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備3份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得松果菊苷峰面積的RSD為1.3%，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.4%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，分別于0、2、4、8、16、24 h測(cè)定，松果菊苷與毛蕊花糖苷峰面積值的RSD分別為1.6%和1.8%。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取9份含量已知的芪蓉潤(rùn)腸口服液，分別加入等量低濃度(松果菊苷41.04 μg，毛蕊花糖苷1.79 μg)、中濃度(松果菊苷51.30 μg，毛蕊花糖苷2.24 μg)、高濃度(松果菊苷61.65 μg，毛蕊花糖苷2.69 μg)的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得松果菊苷平均加樣回收率為99.9%，RSD為1.2%，毛蕊花糖苷平均加樣回收率為100.3%，RSD為1.3%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9樣品含量測(cè)定按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4個(gè)批號(hào)的芪蓉潤(rùn)腸口服液各3份。結(jié)果4個(gè)批次芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷的質(zhì)量濃度分別為1 157.46、343.86、905.54、1 527.40 μg/mL，平均質(zhì)量濃度為983.57 μg/mL；毛蕊花糖苷的質(zhì)量濃度分別為42.87、27.54、48.73、92.21 μg/mL，平均質(zhì)量濃度為52.84 μg/mL。見(jiàn)表2。

表2 芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷與毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

近年來(lái)，對(duì)肉蓯蓉生藥、商品藥材及部分復(fù)方制劑中松果菊苷和毛蕊花糖苷進(jìn)行的HPLC法測(cè)定的報(bào)道較多[8-10]，但對(duì)芪蓉潤(rùn)腸口服液中相關(guān)成分含量測(cè)定的報(bào)道尚不多見(jiàn)。本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同批號(hào)之間毛蕊花糖苷含量與松果菊苷含量差異大，且同一批次中毛蕊花糖苷含量均較松果菊苷低，分析原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)肉蓯蓉生長(zhǎng)環(huán)境不同：目前肉蓯蓉野生資源瀕臨枯竭，需依靠人工栽培的肉蓯蓉來(lái)滿足國(guó)內(nèi)外與日俱增的市場(chǎng)需求。但人工栽培和野生肉蓯蓉在生長(zhǎng)環(huán)境、年限以及采收加工方式上均有一定的差異，其藥材有效成分含量也存在著差異。據(jù)徐榮等[11]等研究，人工栽培肉蓯蓉中松果菊苷含量高于毛蕊花糖苷含量，而野生肉蓯蓉中2種苷類成分的含量是較為接近的。本研究結(jié)果顯示，不同批次藥品中毛蕊花糖苷含量均低于松果菊苷含量，推測(cè)芪蓉潤(rùn)腸口服液中使用的肉蓯蓉可能為人工栽培。(2)肉蓯蓉品系不同：正品肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY. D. Ma，而全國(guó)不少地區(qū)將同屬植物鹽生肉蓯蓉C.salsa(C. A. Mey) C. Beck和管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schenk) R. Wight也作為肉蓯蓉入藥。王義明等[12]相關(guān)研究表明，苯乙醇苷類化合物含量在3種肉蓯蓉中存在較大差異。因此本研究中各個(gè)批次間松果菊苷與毛蕊花糖苷的含量差異較大，可能由入藥的肉蓯蓉品系不同所導(dǎo)致。(3)光敏感性：松果菊苷與毛蕊花糖苷都是易分解的成分，對(duì)強(qiáng)光較敏感，不同批次供試品制備時(shí)可能因?qū)嶒?yàn)室光線強(qiáng)度不同或供試品保存時(shí)間不盡一致，使各批次含量測(cè)定結(jié)果差異較大。

綜上所述，本研究使用HPLC法測(cè)定芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷與毛蕊花糖苷，該法靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確、方便易行，適用于芪蓉潤(rùn)腸口服液中松果菊苷與毛蕊花糖苷的測(cè)定。