黑果枸杞多糖提取及脫蛋白、脫色最佳工藝的研究

賈文聰， 伊明·尕哈甫， 古麗格娜·吐爾地， 陳丹溪， 李玉玲， 王晨琪， 古麗巴哈爾·卡吾力

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)2014-2班； 2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，主要分布于我國的寧夏、青海、新疆等西部地區(qū)[1-2]。黑果枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴藥材，主要化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、黃酮、原花青素、微量元素以及氨基酸等，長期服用具有保護(hù)視力、防治糖尿病、保肝、抗腫瘤、降壓，保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[3-4]。黑果枸杞多糖(LyciumruthenicumMurr. polysaccharides，LBP)是其中的主要有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化以及降血糖、降血脂等功效，臨床多用于治療胃癌、肝癌[5-14]。目前，黑果枸杞多糖的提取方法主要有水浸提取法、酸堿法、超聲波提取法、微波法、酶法等。本研究分別采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計，通過超聲波提取黑果枸杞多糖，采用Saveg法和過氧化氫法，探究黑果枸杞多糖的提取、脫蛋白、脫色的最佳工藝，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑牛血清白蛋白(純度≥98%，南京奧多富尼生物科技有限公司，批號20170510)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，純優(yōu)生物制品有限公司，批號20170314)，木瓜蛋白酶(活力單位≥600 U/g，壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號20170112)，苯酚(濟(jì)南鈞源化工有限公司，批號20161203)，濃硫酸(天地奧化工有限公司，批號20170320)，無水乙醇(濟(jì)南鈞源化工有限公司，批號20170403)，石油醚(西安義信化工有限公司，批號20161124，沸程60-90℃)；乙醚(西安義信化工有限公司，批號20161025)，95%乙醇(濟(jì)南鈞源化工有限公司，批號20170104)，丙酮(濟(jì)南鈞源化工有限公司，批號20170316)，試劑均為分析純。

1.2儀器UV-9100型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)，XL-02A型扣壓式小型粉碎機(jī)(旭朗機(jī)械有限公司)，HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器有限公司)，SHZ型循環(huán)真空泵(鄭州博科儀器設(shè)備有限公司)，XPE型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DP-D65UE型多用途恒溫超聲波提取機(jī) (無錫德譜儀器制造有限公司)。

1.3藥材黑果枸杞2016年4月采自于新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市，經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥/天藥教研室帕麗達(dá)教授鑒定為茄科枸杞屬植物黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)的干燥果實(shí)。

1.4方法

1.4.1 多糖的提取方法 將采集的黑果枸杞清洗后在陰涼處干燥至恒重，用粉碎機(jī)粉碎并過40目篩，采用索氏提取器用石油醚提取6.0 h脫脂后，加入500 mL蒸餾水于80℃水浴攪拌加熱2 h，過濾，濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液，3 000 r/min離心15 min，將提取液減壓濃縮至200 mL，加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，于4℃醇沉12 h后，離心分離，收集沉淀，依次用95%乙醇，無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌2次，真空干燥至恒重，即得黑枸杞多糖。

1.4.2 多糖含量測定方法學(xué)考察

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg置于500 mL 容量瓶中定容，分別吸取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL，加入1.0 mL 6%的苯酚后混勻，迅速加入 5.0 mL 濃硫酸，靜置 5 min 后混勻，水浴加熱 5 min，冷卻至室溫，測定490 nm 處吸光度，以 2.0 mL 蒸餾水作為空白對照。以吸光度值為縱坐標(biāo)(X)，葡萄糖含量(Y)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.013 8X+0.023 4，R2=0.999 1。

1.4.2.2 精密度試驗(yàn) 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測定5次，RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%,表明試驗(yàn)度良好。

1.4.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法分別在0、2、4、6、8、10 h測定，RSD分別為2.1%、1.3%、1.5%,表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

1.4.2.4 加樣回收率考察 吸取9份已知多糖濃度的供試品1.0 mL，分別加入0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法測定，平均回收率分別為99.73%、98.01%、99.12%。

1.4.3 超聲波提取黑果枸杞多糖 稱取5份脫脂處理后的黑果枸杞各1.0 g，設(shè)置料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超聲時間(15、30、45、60、75 min)、超聲功率(40、50、60、70、80 W)，在90℃進(jìn)行超聲波提取，提取液醇沉洗滌，離心、冷凍干燥，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法測定，按公式：多糖提取率/%=X1/X2×100%[式中：X1為黑果枸杞多糖質(zhì)量(μg)；X2為黑果枸杞藥材質(zhì)量(μg)]計算多糖提取率。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化提取方法，見表1。

表1 多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表

1.4.4 黑果枸杞多糖Saveg法脫蛋白工藝

1.4.4.1 蛋白標(biāo)含量測定 稱取牛血清白蛋白20 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解后稀釋至刻度制成貯備液。分別吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加水稀釋至l0 mL，向各管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250，以蒸餾水為空白，在465 nm處測定蛋白質(zhì)含量，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線方程為Y=0.014 8X+0.330 1，R2=0.999 2。

1.4.4.2 黑果枸杞多糖脫蛋白工藝 稱取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。吸取粗多糖溶液2.0 mL，固定Saveg試劑中氯仿∶正丁醇=1∶4比例，設(shè)置Saveg試劑與粗多糖溶液比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、處理時間(60、70、80、90、100 min)、處理溫度(55、65、75、85、95℃)進(jìn)行震蕩脫蛋白處理，3 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，上清液按照“1.4.2.1”項(xiàng)下方法測定多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，按公式：多糖保留率/%=X1/X2×100%[式中：X1為黑果枸杞多糖脫蛋白后多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；X2為黑果枸杞多糖脫蛋白前多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)]，計算其多糖保留率,按公式：蛋白脫除率/%=C1/C2×100%[式中：C1為黑果枸杞多糖脫蛋白前粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為黑果枸杞多糖脫蛋白后粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)]， 計算其蛋白脫除率。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)以綜合評分法給予多糖保留率和脫蛋白率各50%權(quán)重計算綜合得分進(jìn)一步優(yōu)化脫蛋白方法，見表2。

1.4.5 黑果枸杞多糖過氧化氫脫色工藝 稱取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成粗多糖溶液。吸取粗多糖溶液2.0 mL，設(shè)置過氧化氫加入量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50%)、處理時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、處理溫度(35、45、55、65、75℃)進(jìn)行處理，離心，棄去沉淀，上清液按照含量測定方法測定多糖質(zhì)量濃度，按公式：脫色率/%=C1/C2×100%[式中：C1為黑果枸杞多糖脫色前粗多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為黑果枸杞多糖脫色后粗多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)]，計算脫色率。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計以多糖脫色率為考察指標(biāo)選擇黑果枸杞多糖脫色工藝參數(shù)，見表3。

表2 Saveg法脫蛋白正交試驗(yàn)因素水平表

表3 過氧化氫法脫色正交試驗(yàn)因素水平表

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1超聲波提取黑果枸杞多糖試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料液比對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項(xiàng)下方法測得多糖提取率，分別考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時黑果枸杞多糖提取率的變化，當(dāng)料液比為1∶10時，多糖提取率為5.80%，達(dá)到最高，故選擇1∶10為料液比，見圖1。

圖1 料液比對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.1.2 超聲時間對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項(xiàng)下方法測得多糖提取率，分別考察超聲時間為15、30、45、60、75 min時黑果枸杞多糖提取率的變化，當(dāng)超聲時間為30 min時，多糖提取率為5.59%，達(dá)到最高，故選擇30 min為超聲時間，見圖2。

圖2 超聲時間對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.1.3 超聲功率對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項(xiàng)下方法測得多糖提取率，分別考察超聲功率為40、50、60、70、80 W時黑果枸杞多糖提取率的變化，當(dāng)超聲功率為60 W時，多糖提取率為5.51%，達(dá)到最高，故選擇60 W為超聲功率,見圖3。

圖3 超聲功率對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，正交試驗(yàn)選擇料液比(1∶10、1∶20、1∶30)、超聲時間(15、30、45 min)、超聲功率(50、60、70 W)3個因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明超聲時間和超聲功率影響最大，各因素對多糖提取率影響主次序?yàn)镃>B>A，超聲提取黑果枸杞多糖的最佳工藝組合為A3B2C1，即料液比為1∶10、超聲時間為30 min、超聲功率為70 W。按照此條件進(jìn)行測定，黑果枸杞多糖的提取率為7.01%，見表4、5。

表4 超聲波提取多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

2.2黑果枸杞多糖脫蛋白工藝結(jié)果

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 Saveg試劑與粗多糖比例對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項(xiàng)下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察Saveg試劑與粗多糖比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當(dāng)Saveg試劑與粗多糖比例為1∶3時，多糖保留率(53.05%)和蛋白脫除率(51.32%)達(dá)到最高，故選擇1∶3為Saveg試劑與粗多糖比例，見圖4。

2.2.1.2 處理時間對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項(xiàng)下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察處理時間為60、70、80、90、100 min時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當(dāng)處理時間為80 min'時，多糖保留率(77.11%)和蛋白脫除率(69.08%)達(dá)到最高，故選擇80 min為處理時間，見圖5。

圖4 Saveg試劑與粗多糖比例對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

圖5 處理時間對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

2.2.1.3 處理溫度對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項(xiàng)下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察處理溫度為55、65、75、85、95℃時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當(dāng)處理溫度為75℃時，多糖保留率(46.89%)和蛋白脫除率(77.26%)達(dá)到最高，故選擇75℃為處理時間，見圖6。

圖6 處理溫度對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，正交試驗(yàn)選擇Saveg試劑加入量(1∶2、1∶3、1∶4)、處理時間(60、70、80 min)、處理溫度(75、85、95℃)3個因素進(jìn)行分析，3個因素影響差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各因素對多糖脫蛋白率影響主次序?yàn)锳 >C>B，黑果枸杞多糖脫蛋白率工藝最佳組合為A1B1C3，即Saveg試劑與粗多糖比例為1∶2，處理時間為60 min、處理溫度為95℃。在此結(jié)果上，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖脫蛋白率為75.46%，為黑果枸杞多糖脫蛋白方法最佳條件，見表6、7。

表6 多糖脫蛋白率正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

2.3黑果枸杞多糖脫色工藝結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 過氧化氫加入量對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項(xiàng)下方法測得多糖脫色率，分別考察過氧化氫加入量為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當(dāng)過氧化氫加入量為0.75%時，多糖脫色率(44.54%)達(dá)到最高，故選擇0.75%為過氧化氫加入量，見圖7。

圖7 過氧化氫的加入量對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.1.2 處理時間對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項(xiàng)下方法測得多糖脫色率，分別考察處理時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當(dāng)處理時間為2 h時，多糖脫色率(45.97%)達(dá)到最高，故選擇2 h為處理時間，見圖8。

圖8 處理時間對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.1.3 處理溫度對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項(xiàng)下方法測得多糖脫色率，分別考察處理溫度為35、45、55、65、75 ℃時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當(dāng)處理溫度為55 ℃時，多糖脫色率(53.58%)達(dá)到最高，故選擇55 ℃為處理溫度，見圖9。

圖9 處理溫度對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，正交試驗(yàn)選擇過氧化氫加入量(0.75、1.00、1.25%)、處理時間(1.0、1.5、2.0 h)、處理溫度(35、45、55℃)3個因素進(jìn)行分析，3個因素的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各因素對多糖脫色率影響主次序?yàn)锽>C>A，黑果枸杞多糖脫色率工藝最佳組合為A2B3C2，即過氧化氫加入量為1.0%，處理時間為2.0 h、處理溫度為45℃。在此結(jié)果上，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖脫色率為62.34%，為黑果枸杞多糖脫色方法最佳條件，見表8、9。

表8 多糖脫色率正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 方差分析結(jié)果

3 討論

黑果枸杞是藥食兩用的珍貴藥材，它生長在人類無法生存的荒山野嶺、河床沙灘，擁有著極強(qiáng)的生命力。但隨著人類對大自然的開發(fā)，黑果枸杞的生存空間愈來愈少，造就了黑果枸杞這一珍稀珍貴的原生態(tài)高檔滋補(bǔ)佳品。研究表明黑枸杞含蛋白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分，比一般紅枸杞更珍貴更有藥用價值，用于治療心熱病、心臟病、降低膽固醇、興奮大腦神經(jīng)、增強(qiáng)免疫功能、防治癌癥、抗衰老、美容養(yǎng)顏、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等且藥效顯著[15-20]。

本研究以多糖提取率為評價指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計，分別超聲波方法提取多糖，確定黑果枸杞多糖提取條件。結(jié)果顯示超聲波提取多糖時，料液比為1∶10、超聲時間為30 min、超聲功率為70W時多糖提取率就可以達(dá)到7.01%。以蛋白脫除率和多糖保留率為考察指標(biāo)對黑果枸杞多糖進(jìn)行脫蛋白，當(dāng)Saveg試劑與粗多糖比例為1∶2，處理時間為60 min、處理溫度為95℃。在此結(jié)果上，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖脫蛋白率為75.46%。以脫色率為評價指標(biāo)對黑果枸杞多糖進(jìn)行脫色，當(dāng)過氧化氫加入量為1.0%，處理時間為2.0 h、處理溫度為45 ℃時多糖脫色率為62.34%。通過上述試驗(yàn)對黑果枸杞多糖進(jìn)行提取、脫蛋白和脫色，得到淡黃色多糖粉末，其工藝結(jié)果穩(wěn)定、可靠、影響因素較少，初步確定為黑果枸杞多糖提取、脫蛋白和脫色工藝，為黑果枸杞后續(xù)研究提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。