養(yǎng)豬業(yè)常用抗生素的發(fā)光細菌急性毒性研究

曾 卓， 施 城， 施一妃， 鄭 平

(1.浙江大學 環(huán)境工程系， 杭州 310058； 2.浙江大學 臨床醫(yī)學系， 杭州 310058)

隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，獸用抗生素被廣泛使用。抗生素是一類由微生物代謝產(chǎn)生，能抑制其它微生物生長和代謝的物質(zhì)，可用來治療和預防疫病。亞治療水平的抗生素常用作飼料添加劑，以期提高豬的生長速率和飼料效率[1-2]。在我國農(nóng)業(yè)部頒布的《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中，允許長期飼用的抗生素多達33種，允許醫(yī)用的抗生素也達24種[3]。限于我國養(yǎng)豬業(yè)的飼養(yǎng)水平，許多養(yǎng)豬業(yè)主都將抗生素視為防控疫病的唯一手段，導致抗生素濫用現(xiàn)象極為普遍?？股仉S排泄物進入廢水，可抑制微生物生長和代謝，從而影響廢水生物處理[4]。

養(yǎng)豬業(yè)是主要的農(nóng)業(yè)污染源。豬場廢水通常采用生物處理，達到排放標準后進入納污管道或受納水體[5]。據(jù)文獻報道，豬場廢水中的抗生素會對生物處理系統(tǒng)中的污染物降解菌產(chǎn)生明顯的抑制作用。孫建平等發(fā)現(xiàn)，豬場廢水中存在10 mg·L-1阿莫西林時，試驗組的最大甲烷產(chǎn)率只有不含阿莫西林的對照組的41%[6]。Lallai[7]等發(fā)現(xiàn)，濃度為80 mg·L-1的甲砜霉素會導致豬場糞漿厭氧消化的累積產(chǎn)甲烷量減少40%。抗生素對廢水生物處理的影響不容忽視，值得系統(tǒng)研究。

發(fā)光細菌(Luminescent bacterium)是一種能發(fā)生熒光的微生物，Photobacteriumphosphoreum是發(fā)光細菌的典型代表。P.phosphoreum的發(fā)光機理是黃素單核苷酸(FMNH2)與熒光素酶(luciferase)結合，在氧氣的作用下，形成結合于熒光素酶上的4a-過氧化黃素復合體(a luciferase-bound 4a-peroxyflavin)，該復合體再與脂肪醛反應，生成一種穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，這種中間產(chǎn)物緩慢分解，釋放光子[8]：

在正常生長條件下，發(fā)光細菌的發(fā)光強度穩(wěn)定。但遇到外來毒性物質(zhì)時，發(fā)光細菌的發(fā)光強度衰減，衰減程度與抑制強度正相關。發(fā)光細菌急性毒性測試法具有成本低、速度快和靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品添加劑等急性毒性的測試[9～11]。但迄今為止，還未見發(fā)光細菌急性毒性測試法應用于養(yǎng)豬業(yè)常用抗生素急性毒性測試的報道[12]。有鑒于此，筆者采用發(fā)光細菌急性毒性測試法，系統(tǒng)地檢測了7類，9種獸用抗生素的急性毒性，并分析了所試抗生素的毒性機理，以期為豬場廢水生物處理工程的設計和優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

鹽酸金霉素(USP級)、氯霉素(98%)、青霉素G鈉(1650 U·mg-1)、恩諾沙星(98%)、桿菌肽(Titer> 60 Units·mg-1)、硫酸鏈霉素(720 IU·mg-1)、硫酸多粘菌素E(USP級)、氟苯尼考(≥99%)、林可霉素(95%)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。NaCl，NaOH，HCl，乙酸均為分析純。

1.1.2 菌種

明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)T3變種，購自中國科學院南京土壤研究所。菌液制備過程如下：將保存在4℃下的發(fā)光細菌凍干粉用1.0 mL，4℃的2%NaCl溶液復蘇，將菌液冰浴保存，30 min后檢測菌液的發(fā)光強度。菌液的初始發(fā)光強度應在600～1900 mV，若低于600 mV時，可將DXY22生物毒性測試儀的倍率調(diào)至“×2”檔，若高于1900 mV，可將倍率調(diào)至“×0.5”檔，若仍不達標，則更換凍干粉。

1.1.3 儀器

DXY22型生物毒性測試儀(中國科學院南京土壤研究所)；pH計(METTLER TOLEDO)；10μL微量進樣器(Agilent公司)。

1.2 抗生素的急性毒性測定

控制室溫在20℃～25℃，首先用3% NaCl溶液分別將水溶性抗生素配成500 mg·L-1母液，用0.1 mol ·L-1的NaOH 或0.1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)母液pH值至6.98～7.02，配置成不同的濃度梯度。以3% NaCl溶液作為空白對照，將空白對照和各濃度抗生素溶液各取2 mL于測試管中，做3組平行。用微量注射器依次取10 μL發(fā)光細菌菌液于各測試管中，振蕩混勻，15 min后用生物毒性測試儀測定發(fā)光強度[13]。

對于不溶于水的抗生素：氟苯尼考，先用1 mL乙酸溶解，然后用3% NaCl溶液配制濃度為100 mg·L-1母液，再制成20，40，60，80，100 mg·L-1的梯度濃度溶液，對應的乙酸濃度是2，4，6，8，10 g·L-1。同時將乙酸用3% NaCl溶液稀釋成梯度濃度溶液，測試乙酸的毒性。測定過程與水溶性抗生素一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過空白對照發(fā)光度(相對發(fā)光單位RLU 表示)的平均值RLU0和各濃度3組平行樣發(fā)光度的平均值RLU，計算發(fā)光細菌的相對抑制率X(%)， 即:

采用Originlab 統(tǒng)計軟件對抗生素濃度與相對抑制率進行線性回歸，用直線內(nèi)插法求出抑制率為50% 時所對應的抗生素濃度，即為該種抗生素對發(fā)光細菌的半抑制濃度(IC50)。

2 結果

在2.00～10.00 g·L-1濃度范圍內(nèi)，林可霉素對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率如圖1所示。根據(jù)擬合方程，算出IC50為19.45 g·L-1。在1.00～8.00 g·L-1濃度范圍內(nèi)，青霉素G鈉對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率如圖1～圖3所示。根據(jù)擬合方程，算出IC50為10.10 g·L-1。在0.50～2.00 g·L-1濃度范圍內(nèi)，桿菌肽對發(fā)光細菌沒有顯著的抑制作用，甚至可促進發(fā)光細菌的發(fā)光強度；但在2.00～8.00 g·L-1濃度范圍內(nèi)，桿菌肽具有抑制作用，IC50為6.91 g·L-1。

圖1 林可霉素與發(fā)光抑制率的關系

圖2 青霉素G鈉與發(fā)光抑制率的關系

圖3 桿菌肽濃度與發(fā)光抑制率的關系

在200～600 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，氯霉素對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率見圖4，算出IC50為473 mg·L-1。在100～275 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，恩諾沙星對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率見圖5，算出IC50為157 mg·L-1。在100～500 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，硫酸鏈霉素對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率見圖6，算出IC50為142 mg·L-1。在20～100 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，不溶于水的抗生素氟苯尼考對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率見圖7，算出IC50為95 mg·L-1。

圖4 氯霉素與發(fā)光抑制率的關系

圖5 恩諾沙星與發(fā)光抑制率的關系

圖6 硫酸鏈霉素與發(fā)光抑制率的關系

圖7 氟苯尼考濃度與發(fā)光抑制率的關系

圖8 鹽酸金霉素與發(fā)光抑制率的關系

圖9 硫酸多粘菌素E與發(fā)光抑制率的關系

在5～20 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，鹽酸金霉素對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率如圖8所示，算出IC50為12 mg·L-1。在1～8 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，硫酸多粘菌素E對發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率如圖9所示，算出IC50為4 mg·L-1。

乙酸的毒性也被考察，乙酸的濃度(5.00～40.00 g·L-1)與發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率呈現(xiàn)非線性增長關系(見圖10)。但在濃度范圍5.00～20.00 g·L-1內(nèi)，乙酸濃度與發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率呈線性增長關系，IC50為12.35 g·L-1。表1總結了9種抗生素和乙酸在線性變化區(qū)域的濃度與發(fā)光抑制率的擬合方程，并給出了IC50。

圖10 乙酸濃度與發(fā)光抑制率的關系

藥品種類線性范圍線性回歸方程(X為濃度,Y為發(fā)光強度抑制率)相關系數(shù)IC50林可霉素2 g·L-1～10 g·L-1Y=2.480X+1.7690.85619.45 g·L-1青霉素G1 g·L-1～8 g·L-1Y=5.143X-1.9570.98910.10 g·L-1桿菌肽2 g·L-1～8 g·L-1Y=11.284X-28.0050.9866.91 g·L-1氯霉素200 mg·L-1～600 mg·L-1Y=0.095X+5.0880.934473 mg·L-1恩諾沙星100 mg·L-1～275 mg·L-1Y=0.150X+26.4390.895157 mg·L-1鏈霉素100 mg·L-1～500 mg·L-1Y=0.317X+5.1290.946142 mg·L-1氟苯尼考20 mg·L-1～100 mg·L-1Y=0.628X-9.4480.98495 mg·L-1金霉素5 mg·L-1～20 mg·L-1Y=4.632X-4.5270.98112 mg·L-1多粘菌素E1 mg·L-1～8 mg·L-1Y=8.876X+13.9630.9944 mg·L-1乙酸5 g·L-1～20 g·L-1Y=2.921X+13.930.97212.35 g·L-1

3 討論

本課題測定了7大類，9種抗生素對發(fā)光細菌的急性毒性。它們分別是β-內(nèi)酰胺類：青霉素G；林可酰胺類：林可霉素；多肽類：桿菌肽、多粘菌素E；氨基糖苷類：鏈霉素；四環(huán)素類：金霉素；氯霉素類：氯霉素、氟苯尼考；喹諾酮類：恩諾沙星。借鑒環(huán)境毒物的毒性分類標準，9種抗生素可分為3類：輕度毒性(IC50>500 mg·L-1)的抗生素有：林可霉素、青霉素G鈉和桿菌肽；中度毒性(500 mg·L-1> EC50>50 mg·L-1)的抗生素有：氯霉素、恩諾沙星、鏈霉素和氟苯尼考；高度毒性(50 mg·L-1> EC50>1 mg·L-1)的抗生素有：金霉素和多粘菌素E。

青霉素G的作用靶點是細菌細胞膜上的青霉素結合蛋白(PBP)。PBP參與細菌細胞壁的合成、維持和調(diào)整。青霉素G鈉通過抑制PBP從而阻礙細胞壁合成，導致細菌細胞滲透裂解[14]。桿菌肽的作用靶點是C55-O-PO3。C55是細胞膜上的脂質(zhì)載體，在細胞壁合成過程中起著轉(zhuǎn)移肽聚糖單體(二糖五肽單元)的作用。桿菌肽與C55-O-PO3形成配合物，阻斷C55再生循環(huán)，從而阻礙細胞壁合成[15-16]。林可霉素不可逆地結合于細菌核糖體的50S亞基，從而抑制細菌蛋白質(zhì)合成。這3種抗生素的IC50>500 mg·L-1，說明其對發(fā)光細菌的毒性很小。據(jù)報道，青霉素G和桿菌肽主要抑制革蘭氏陽性細菌，林可霉素僅抑制革蘭氏陽性細菌[16-17]。試驗所用的P.phosphoreum是一種革蘭氏陰性細菌，因此3種抗生素無明顯抑制效應。

恩諾沙星屬喹諾酮類抗生素，其抑菌機理是抑制細菌拓撲異構酶Ⅱ(DNA促旋酶)，阻礙DNA復制而停止細菌繁殖，對革蘭氏陰性細菌和陽性細菌都有抗菌效果[18-19]。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，可在許多環(huán)節(jié)抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。氨基糖苷類抗生素可抑制70S上轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成；選擇性地結合于30S亞基的靶蛋白上，導致mRNA錯譯；阻礙終止因子與核蛋白體結合，難以釋放所合成的肽鏈。在氨基糖苷類抗生素中，鏈霉素的抗菌譜較窄，但可有效抑制革蘭氏陰性細菌[18]。

氯霉素和氟苯尼考同屬于氯霉素類的抗生素，其作用機理相似，都是結合于細菌核糖體上的50S亞基，抑制蛋白質(zhì)合成[20-21]。兩者對革蘭氏陽性細菌和陰性細菌均有抑制效果[18]。氟苯尼考不溶于水，以乙酸溶解后需考慮乙酸的毒性。從圖4中可以看出，乙酸對發(fā)光細菌也有抑制作用，其抑制機理是：在一定pH值條件下，未解離的乙酸可直接跨膜進入細胞質(zhì)內(nèi)，消除膜內(nèi)外質(zhì)子濃度差，阻礙ATP合成[22]。氟苯尼考的IC50=95 mg·L-1，而乙酸的IC50=12.35 g·L-1。氟苯尼考的抑制作用是氟苯尼考和乙酸聯(lián)合作用的結果，但主要是氟苯尼考的貢獻。

金霉素屬于四環(huán)素類抗生素，作用機理是干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，還可引起細胞膜通透性的改變，造成細胞質(zhì)成分外漏。金霉素可抑制革蘭氏陰性細菌和陽性細菌[23]。金霉素對發(fā)光細菌的毒性很大，IC50為12 mg·L-1。多粘菌素E的抑菌機理是其聚陽離子環(huán)與脂多糖的脂A發(fā)生作用，插入細胞膜的磷脂層中，破壞細胞的完整性。多粘菌素E分子帶有5個正電荷，可穿透革蘭氏陰性細菌的細胞外膜和內(nèi)膜，毒性很大，IC50只有4 mg·L-1 [24-25]。

養(yǎng)豬業(yè)常用9種抗生素的抑菌機理和抗菌譜見表2。從半抑制濃度看，當廢水中含有輕度毒性抗生素：青霉素G，桿菌肽和林可霉素時，對生物處理功能菌的影響不大；當殘留中度毒性抗生素：鏈霉素、恩諾沙星、氯霉素、氟苯尼考時，需要檢測其濃度，以確定是否產(chǎn)生抑制作用；當殘留高度毒性抗生素：金霉素和多粘菌素E時，應采取預處理措施消除抗生素活性再進行生化處理。

表2 養(yǎng)豬業(yè)常用抗生素的抗菌機理和抗菌譜

注：G+菌指革蘭氏陽性菌;G-菌指革蘭氏陰性菌。

4 結論

采用發(fā)光細菌急性毒性測試法，測定了養(yǎng)豬業(yè)常用的9種抗生素的急性毒性，試驗證明，9種抗生素的急性毒性大小為：多粘菌素E >金霉素 >氟苯尼考 >恩諾沙星 >鏈霉素 >氯霉素 >桿菌肽 >青霉素G >林可霉素。林可霉素、青霉素G和桿菌肽有輕度急性毒性，IC50分別為19.45 g·L-1，10.10 g·L-1，6.91 g·L-1；氯霉素、鏈霉素、恩諾沙星和氟苯尼考有中度急性毒性，IC50分別為473 mg·L-1，142 mg·L-1，157 mg·L-1和95 mg·L-1；金霉素和多粘菌素E有高度急性毒性，IEC50分別為12 mg·L-1和4 mg·L-1。