廣西姑婆山野生柑橘資源花粉形態(tài)觀察及其系統(tǒng)分類學(xué)研究

唐 艷，武曉曉,2，劉冰浩，陳傳武，牛 英，鄧崇嶺*

(1 廣西特色作物研究院，廣西柑橘生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；2 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

寬皮柑橘是中國(guó)栽培分布最廣、資源最豐富的一個(gè)柑橘類群，在柑橘演化、分類上具有十分重要的地位。Barrett 等[1]指出，在柑橘亞屬中只有3個(gè)真正的種，即枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和寬皮橘(C.reticulata)，其他重要的栽培柑橘種類為雜種起源。20世紀(jì)80 年代前柑橘學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，寬皮柑橘近緣野生種只有印度野橘(C.indica)和立花橘(C.tachibana)2種[2]，而中國(guó)是否存在寬皮柑橘的近緣野生種，是國(guó)際柑橘學(xué)術(shù)界十分關(guān)注的問(wèn)題。中國(guó)柑橘工作者對(duì)此作了大量調(diào)查研究工作。20世紀(jì)50～60年代以來(lái)，湖南、廣西等地開(kāi)展了多次柑橘資源普查，在湖南道縣、宜章縣、江永縣及廣西賀州市(原賀縣)等地先后發(fā)現(xiàn)了道縣野橘、莽山野柑、姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘等野生柑橘，這些野生材料的發(fā)現(xiàn)有利于了解柑橘的起源、親緣關(guān)系和遺傳演化規(guī)律。

廣西地跨北熱帶、南亞熱帶和中亞熱帶，地質(zhì)起源古老，地形地貌十分復(fù)雜，北有南嶺山脈，西臨云貴高原，境內(nèi)六萬(wàn)大山、九萬(wàn)大山連綿數(shù)千里，多山多雨的獨(dú)特地理環(huán)境孕育了豐富的柑橘種質(zhì)資源。1963～1964年，曾勉及葉蔭民先后在廣西進(jìn)行柑橘考察時(shí)，對(duì)賀州市(原賀縣)姑婆山的野橘進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)鑒定，暫定名為元橘(SinocitruschuanaTseng)[3]；石健泉于1978年和1984年2次到姑婆山一帶進(jìn)行考察，對(duì)姑婆山野生元橘的分布、生存的生態(tài)環(huán)境以及形態(tài)特征進(jìn)行了分析[3]；石健泉最后根據(jù)調(diào)查結(jié)果，將姑婆山野生元橘分為皺皮柑和元橘[4]；鄧崇嶺等[5]對(duì)姑婆山野生皺皮柑和野生元橘進(jìn)行了復(fù)查，并從地理分布、生境和形態(tài)特征方面進(jìn)行了分析，認(rèn)為姑婆山野生皺皮柑和野生元橘可能是柑橘屬中的新類型。

柑橘是世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，柑橘的分類一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,但至今都沒(méi)有一個(gè)權(quán)威的、完整的柑橘分類系統(tǒng)。植物花粉有其獨(dú)特的外形、復(fù)雜的外壁結(jié)構(gòu)和精細(xì)的紋飾，并且在遺傳中具有相對(duì)較強(qiáng)的保守性和穩(wěn)定性，這對(duì)植物種和品種的鑒定具有重要的意義?；诖?，本研究利用花粉形態(tài)特征對(duì)姑婆山野生皺皮柑和野生元橘進(jìn)行分析，為其遺傳演化、分類地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供參考依據(jù)[6]。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)所用的姑婆山野生皺皮柑、姑婆山野生元橘和部分試驗(yàn)材料的花粉采自廣西特色作物研究院資源圃，其余材料的花粉采自中國(guó)農(nóng)科院柑桔研究所(重慶)，共計(jì)28份材料(表1)。

于盛花期選擇健壯植株，采集樹冠外圍中上部含苞待放的花蕾，用消過(guò)毒的鑷子去掉花瓣和花萼，只留花藥，置于烘箱內(nèi)37 ℃烘24 h以上，將獲得的花粉放置于干燥管中低溫保存。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及測(cè)定方法

1.2.1花粉電鏡掃描觀察用牙簽挑取少量花粉，均勻撒在粘有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，用離子濺射儀進(jìn)行真空噴金鍍膜，置于FEI Quanta 200場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡下進(jìn)行觀察，工作電壓為5 kV,選擇有代表性的清晰視野進(jìn)行觀察，并拍照保存，800倍觀察花粉的整體效果，6 000倍觀察花粉的極面和赤道面，24 000倍觀察花粉的外壁紋飾特征，并測(cè)量極軸長(zhǎng)(P)、赤道軸長(zhǎng)(E)、網(wǎng)脊寬度(W)以及網(wǎng)眼直徑(D)的大小?；ǚ勖枋鰠⒄誛alker[7]的研究方法。

1.2.2花粉定量特征的測(cè)量及統(tǒng)計(jì)每份試驗(yàn)材料隨機(jī)選取20?；ǚ哿＿M(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)量和統(tǒng)計(jì)，用SPSS軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選取赤道軸長(zhǎng)、極軸長(zhǎng)、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)脊寬度、極軸赤道軸比值和網(wǎng)眼網(wǎng)脊比值共6個(gè)定量特征，用NTsys-pc軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類,聚類單元之間的遺傳距離以平均分類距離計(jì)算，聚類圖選用UPGMA法。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的外形大小

姑婆山野生皺皮柑花粉以單粒形式存在，中等大小，存在4條孔溝，花粉粒形狀為長(zhǎng)球形，極軸長(zhǎng)度為(35.24±1.94)μm，赤道軸長(zhǎng)度為(20.39±1.35)μm，P/E均值為1.73(表1)，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長(zhǎng)圓形。姑婆山野生元橘花粉都以單粒形式存在，中等大小，存在4條孔溝，花粉粒形狀為長(zhǎng)球形，極軸長(zhǎng)度為(30.21±1.14)μm，赤道軸長(zhǎng)度為(22.12±1.97)μm，P/E均值為1.37，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長(zhǎng)圓形(圖版Ⅰ、圖版Ⅱ)。

2.2 花粉的外壁紋飾

姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘的外壁紋飾均為網(wǎng)狀紋飾，即由凸起的網(wǎng)脊和網(wǎng)眼組成，網(wǎng)眼和保衛(wèi)網(wǎng)眼的一半網(wǎng)脊形成一個(gè)網(wǎng)胞。但是兩者網(wǎng)脊的寬窄、網(wǎng)眼的形狀、大小存在差異。姑婆山野生皺皮柑網(wǎng)眼較大，形狀為不規(guī)則圓形或多邊形，網(wǎng)眼直徑為(1.65±0.09)μm，網(wǎng)脊較狹且突出，寬度為(0.51±0.10)μm。姑婆山野生元橘網(wǎng)眼較小，形狀多為圓形或近圓形，網(wǎng)眼直徑為(0.86±0.08)μm，網(wǎng)脊平寬光滑，寬度為(0.47±0.09)μm(圖版Ⅲ)。

2.3 聚類結(jié)果分析

利用NTsys軟件對(duì)花粉6個(gè)定量特征進(jìn)行聚類分析，在遺傳距離0.827處，將試驗(yàn)材料分為9個(gè)組群(圖1)

第Ⅰ組為羅浮金柑，單獨(dú)成一組；

第Ⅱ組為道縣野橘，單獨(dú)成一組，在遺傳距離1.20處，道縣野橘和羅浮金柑聚為一組；

第Ⅲ組為23號(hào)枳，是枳屬品種，單獨(dú)成一組；

第Ⅳ組包括金刀峽宜昌橙和紅河大翼橙，網(wǎng)眼略大，網(wǎng)脊較窄，網(wǎng)眼不規(guī)則。

第Ⅴ組包括8、11、12、13、14、18、21、25、26、27、28共11個(gè)品種，該組材料主要為柑橘屬，其中姑婆山野生元橘在遺傳距離0.07處與岑溪酸橘聚為一組，在遺傳距離0.10處又和印度酸橘聚為一組(圖1)；

第Ⅵ組包括10、16、17、19、20、22、23、24共8個(gè)品種，該組主要為橘類。

第Ⅶ組為沙田柚，單獨(dú)成一組；

第Ⅷ組包括莽山野柑(尖葉)、莽山野柑(圓葉)，該組品種主要特點(diǎn)為網(wǎng)眼較大，網(wǎng)脊較狹并且突出。其中在遺傳距離0.261處莽山野柑(尖葉)與莽山野柑(圓葉)聚為一組(圖1)，是最特別、最原始的野生柑橘。

第Ⅸ組為姑婆山野生皺皮柑，網(wǎng)眼較莽山野柑小而網(wǎng)脊較寬，且在遺傳距離0.976處與莽山野柑(尖葉)、莽山野柑(圓葉)聚為一組。

3 討 論

姑婆山野生皺皮柑花粉的網(wǎng)眼比較大，網(wǎng)脊狹且突出較高，與莽山野柑尖葉[8]、莽山野柑圓葉的花粉形態(tài)相近，與劉庚峰等[9]對(duì)寬皮柑橘野生種花粉形態(tài)研究的結(jié)果一致；柑橘花粉形態(tài)進(jìn)化途徑通常為：較原始柑橘的花粉均為大型，網(wǎng)眼大，網(wǎng)脊比較窄，較進(jìn)化的柑橘花粉為小型，網(wǎng)眼小，網(wǎng)脊較寬[9-11]，由花粉形態(tài)相近推測(cè)姑婆山野生皺皮柑與莽山野柑一樣可能為柑類的原始種，也可能是柑橘屬中的新類型，這與鄧崇嶺等[5]對(duì)廣西賀州姑婆山野生柑橘資源復(fù)核調(diào)查的結(jié)果一致；姑婆山野生皺皮柑在遺傳距離0.92處與莽山野柑尖葉、莽山野柑圓葉聚為一組，說(shuō)明三者有一定的親緣關(guān)系，結(jié)果與劉冰浩等[12]對(duì)廣西地方柑橘資源ISSR分析分子標(biāo)記的結(jié)果一致；王福生等[13]應(yīng)用cpSSR 和EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行柑橘特異種質(zhì)資源遺傳背景研究中，聚類分析莽山野柑均與元橘聚為一組，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)材料的核對(duì)，研究中的元橘實(shí)為姑婆山野生皺皮柑，因此本研究試驗(yàn)結(jié)果與此相一致。聚類分析結(jié)果表明，莽山野柑(尖葉)和莽山野柑(圓葉)先聚在一起，然后與姑婆山野生皺皮柑聚為一類，在遺傳距離1.64處才與枳屬、金柑屬及柑橘屬的其他類型聚在一起，具有獨(dú)立的、特別的原始性，不屬于柑橘屬中的寬皮柑橘、柚、橙和枸椽等種類，且花粉特征原始，推測(cè)莽山野柑(姑婆山野生皺皮柑)應(yīng)該為柑橘屬內(nèi)獨(dú)立的一個(gè)種，是除枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和寬皮柑橘(C.reticulata)外的第4個(gè)真正的種，或者有可能是除枳屬、金柑屬和柑橘屬外的一個(gè)獨(dú)立屬。與鐘廣炎(未發(fā)表資料)認(rèn)為莽山野柑不應(yīng)當(dāng)視為寬皮柑橘，而應(yīng)該是一個(gè)獨(dú)立的柑橘屬種的觀點(diǎn)基本一致[14]。也與Guohong Albert Wu等[15]的最新研究結(jié)果基本一致。當(dāng)然，如要明確莽山野柑(姑婆山野生皺皮柑)是一個(gè)真正的種或者獨(dú)立的屬，則需進(jìn)一步結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)及基因組學(xué)等的研究加以確定。

表1 試驗(yàn)材料以及花粉電鏡掃描形態(tài)特征

姑婆山野生元橘的網(wǎng)眼較小，網(wǎng)脊平寬光滑，與岑溪酸橘、印度酸橘的花粉形態(tài)相近，與劉庚峰等[9]

圖1 基于花粉形態(tài)的柑橘資源聚類圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for citrus germplasm based on pollen morphology

研究寬皮柑橘野生種的花粉形態(tài)認(rèn)為元橘與道縣野橘的花粉形態(tài)比較相近的結(jié)果不一致；石健泉對(duì)姑婆山野生元橘進(jìn)行了調(diào)查，從主要的植物性狀分析，元橘與道縣野橘很相似，認(rèn)為這些性狀可能是出自同源祖先的一群個(gè)體[3]；劉冰浩等[12]對(duì)廣西地方柑橘資源ISSR分析的聚類顯示，姑婆山野生元橘與道縣野橘、立花橘聚為一組，認(rèn)為姑婆山野生元橘與道縣野橘有一定的親緣關(guān)系。本研究中通過(guò)花粉形態(tài)特征比較及聚類分析得出的結(jié)果與以上研究結(jié)果不一致，姑婆山野生元橘與道縣野橘相比，網(wǎng)脊較窄而網(wǎng)眼較大，推測(cè)姑婆山野生元橘比道縣野橘更具有原始性，可能是寬皮柑橘區(qū)中最原始的野生類型。而道縣野橘卻演化成為一獨(dú)特的種類，能單獨(dú)為一組,但在遺傳距離1.20處與羅浮金柑聚為一組，似乎存在某種親緣關(guān)系，有待進(jìn)一步分析研究。施文格(Swingle W.T)和田中長(zhǎng)三郎(Tgozoburo Tanaka)都認(rèn)為立花橘(C.tachibana)是寬皮柑橘近緣野生種，從花粉粒大小、網(wǎng)脊寬度、網(wǎng)眼直徑分析結(jié)果表明：姑婆山野生元橘比立花橘要更原始。

柑橘大多數(shù)種是無(wú)融合生殖的，根據(jù)花粉對(duì)柑橘進(jìn)行分類具有更重要的意義，花粉大小、網(wǎng)眼大小、網(wǎng)脊?fàn)顩r是區(qū)分柑橘分類群的重要特征[16]?；ǚ弁獗诩y飾特征受外界條件影響不大，而花粉的形狀和大小受試驗(yàn)條件的影響較大。本研究中花粉形態(tài)特征對(duì)姑婆山野生皺皮柑和姑婆山野生元橘的起源、分類及親緣關(guān)系的鑒定提供了一定的依據(jù)，但需進(jìn)一步結(jié)合解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、基因組學(xué)等方面的研究進(jìn)行更加深入的研究。

圖版Ⅰ 實(shí)驗(yàn)材料花粉形態(tài)掃描電鏡赤道面觀察結(jié)果(×6 000)
1～28 對(duì)應(yīng)品種名見(jiàn)表1
Plate Ⅰ SEM observation results of the experimental materials on equatorial view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

圖版Ⅱ 實(shí)驗(yàn)材料花粉形態(tài)掃描電鏡極面觀察結(jié)果(×6 000)
1～28對(duì)應(yīng)品種名見(jiàn)表1
PlateⅡ SEM observation results of the experimental materials on polar view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

圖版Ⅲ 實(shí)驗(yàn)材料花粉形態(tài)掃描電鏡花粉外壁紋飾觀察結(jié)果(×24 000)
1～28對(duì)應(yīng)品種名見(jiàn)表1
Plate Ⅲ SEM observation results of the experimental materials on pollen exine ornamentation(×24 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1