O-季銨化硫脲殼寡糖的制備及與鯡魚精DNA的相互作用

馮小強(qiáng), 李小芳, 朱元成, 王紅玉

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅 天水 741001)

殼寡糖(COS)是一種來源豐富、無毒、可吸收降解的堿性氨基多糖, 具有生物降解性、生物相溶性和抗菌等多種生理功能活性[1-2], 在食品工業(yè)、紡織、化工、生物工程和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]. 由于殼寡糖分子鏈中存在大量的功能基團(tuán)羥基(—OH)和氨基(—NH2)， 易形成分子間與分子內(nèi)穩(wěn)定的氫鍵, 因此影響殼寡糖的部分活性[4]. 殼寡糖的季銨化是一種重要的改性方法, 由于N-季銨化殼寡糖在氨基上進(jìn)行反應(yīng), 影響殼寡糖氨基自身的聚陽離子型, 從而影響其抗菌能力. 因此, 僅在殼寡糖C3和C6上的羥基進(jìn)行O-季銨化改性, 可保持殼寡糖C2上氨基自身聚陽離子性及形成雙抗菌活性基團(tuán)結(jié)構(gòu)[5-6], 以得到具有更高活性的衍生物.

DNA作為抗癌、抗腫瘤藥物的主要靶點(diǎn)[7], 其藥效與DNA的嵌插鍵合方式及作用程度有關(guān)[8]. 近年來, 新型藥物與DNA的作用方式已引起人們廣泛關(guān)注. 研究藥物分子與DNA間的作用方式有助于了解藥物抗病的作用機(jī)理, 為設(shè)計(jì)和合成新型抗病藥物提供理論依據(jù). 本文先在殼寡糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基上引入硫脲, 得到氨基硫脲殼寡糖(TUCS), 再在C3和C6的羥基上引入季銨鹽基團(tuán), 得到O-季銨化硫脲殼寡糖(QTUCS), 并考察QTUCS與鯡魚精DNA之間的作用方式.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

硫脲(西安化學(xué)試劑廠, 分析純)； 環(huán)氧氯丙烷(汕頭隴西化工廠, 分析純); 2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司, 分析純)； 殼寡糖(濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司,M<5 000)； 鯡魚精DNA(美國Sigma公司, 生化試劑).

UV-2450型紫外可見光譜儀(日本島津公司)； 熱重-差熱分析(TG-DTA)儀(美國Perkin Elmere公司)； Spectrum One型Fourier紅外光譜儀(美國Perkin Elmere公司)； CH1612C型電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司).

1.2 QTUCS的制備

稱取1.30 g殼寡糖溶于50 mL蒸餾水中, 加入4 mL環(huán)氧氯丙烷, 室溫下磁力攪拌1 h. 稱取1.51 g硫脲溶于18 mL無水乙醇中, 加入上述反應(yīng)體系中, 磁力攪拌, 70 ℃回流5 h. 反應(yīng)結(jié)束后冷卻, 抽濾, 將所得樣品先用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇于索式提取器回流提取4 h后, 再用丙酮溶液浸泡12 h, 抽濾, 將得到的樣品于60 ℃電熱恒溫干燥, 即為TUCS, 產(chǎn)率為59.02%.

稱取0.80 g TUCS溶于40 mL異丙醇中, 置于裝有磁力攪拌器和回流裝置的三頸燒瓶中, 緩慢滴加4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的氫氧化鈉溶液, 水浴加熱并攪拌, 使體系溫度在55 ℃下恒溫堿化4 h. 升溫至60 ℃后, 緩慢多次滴加16 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液, 繼續(xù)反應(yīng)4 h. 將反應(yīng)液先用1 mol/mL的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性, 過濾, 再用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇反復(fù)浸泡、洗滌, 最后將濾餅于溫度不低于90 ℃的烘箱中烘干, 即得產(chǎn)物QTUCS, 產(chǎn)率為46.86%， 合成路線如圖1所示.

圖1 QTUCS的合成路線Fig.1 Synthetic route of QTUCS

1.3 QTUCS與鯡魚精DNA的作用

R=ρ(QTUCS)/ρ(DNA).

2 結(jié)果與討論

2.1 QTUCS的表征

圖2為QTUCS的紅外光譜. 由圖2可見, COS原位于1 664 cm-1處較強(qiáng)的酰胺吸收峰和1 599 cm-1附近的 —NH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰, 在QTUCS中分別移至1 633 cm-1和1 603 cm-1處, 峰形變窄. QTUCS在2 924～2 834 cm-1及1 419 cm-1和1 366 cm-1處分別產(chǎn)生了新的吸收峰, 歸屬為甲基和亞甲基產(chǎn)生了新的吸收峰, 同時(shí)C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰, 表明COS中引入了羥丙基三甲基氯化銨的季銨鹽側(cè)鏈. 此外, QTUCS在1 478 cm-1處出現(xiàn)弱的吸收峰, 表明COS中引入了硫脲基團(tuán).

以體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸分別作為溶劑和參比, 在190～500 nm內(nèi)掃描COS,TUCS和QTUCS的紫外光譜, 結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見, COS在233.0，274.5 nm處出現(xiàn)兩個(gè)較弱的吸收峰, TUCS在238.5，273.15 nm處出現(xiàn)兩個(gè)較強(qiáng)的吸收峰, QTUCS在280.0 nm處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰, 與COS和TUCS的吸收峰相比, QTUCS的峰位發(fā)生了紅移, 且吸收強(qiáng)度增加; 同時(shí), QTUCS在213.5 nm處出現(xiàn)一個(gè)較弱的吸收峰.

圖2 QTUCS的紅外光譜Fig.2 IR spectrum of QTUCS

圖3 COS,TUCS和QTUCS的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of COS,TUCS and QTUCS

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下, 以10 ℃/min升溫至900 ℃, 測定QTUCS的TG-DTG曲線, 結(jié)果如圖4所示. 由圖4可見, QTUCS的熱分解分為兩個(gè)階段： 第一階段, 在165 ℃附近有明顯的失重現(xiàn)象, 其失重率為25.9%, 在DTG曲線上的65.5 ℃處有一個(gè)放熱峰, 這是由于QTUCS失去吸附水和自由水所致； 第二階段, 在180～550 ℃有47.3%的失重, 在DTG曲線上的266 ℃處有一個(gè)很強(qiáng)的放熱峰, 可能是由于QTUCS中支鏈的氧化分解所致. 550 ℃后的熱重曲線較平緩, 當(dāng)溫度升至900 ℃時(shí), 仍有18.6%的質(zhì)量剩余.

2.2 QTUCS與鯡魚精DNA的作用方式

2.2.1 QTUCS與鯡魚精作用的紫外-可見吸收光譜 QTUCS與鯡魚精DNA相互作用的紫外-可見吸收光譜如圖5所示. 由圖5可見, QTUCS在238.5 nm(吸光度為1.02)和280.20 nm(吸光度為1.36)處有明顯的特征吸收峰. 在加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的鯡魚精DNA后, QTUCS于238.5 nm處的吸收峰藍(lán)移至233.5 nm處, 吸收峰強(qiáng)度減色至0.661； 當(dāng)加入200 μL鯡魚精DNA后, QTUCS的吸收峰分別藍(lán)移至230.0,272.0 nm處, 吸收峰強(qiáng)度分別減色至0.55,0.88. 由于DNA堿基與嵌入其中的有機(jī)小分子產(chǎn)生電子相互作用, 耦合后的π*軌道因部分填充電子, 使π→π*躍遷幾率減小, 產(chǎn)生了減色效應(yīng)[11]. 因此, QTUCS與鯡魚精DNA間以嵌入方式發(fā)生作用.

圖4 QTUCS的TG-DTG曲線Fig.4 TG-DTG curves of QTUCS

圖5 鯡魚精DNA對(duì)QTUCS紫外-可見吸收光譜的影響Fig.5 Effects of herring sperm DNA on UV-Vis absorption spectra of QTUCS

a. K4Fe(CN)6; b. K4Fe(CN)6+DNA; c. K4Fe(CN)6+DNA+0.8 mL QTUCS; d. K4Fe(CN)6+DNA+1.6 mL QTCUS; e. K4Fe(CN)6+DNA+2.4 mL QTUCS; f. K4Fe(CN)6+DNA+3.2 mL QTUCS. 圖6 QTUCS加入前后鐵氰化鉀-DNA體系的循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammograms of DNA-K4Fe(CN)6system before and after adding QTUCS

在DNA/K4Fe(CN)6體系中加入QTUCS后, 體系的氧化還原峰峰電流減小, ΔEp電位增大. 當(dāng)加入0.8 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的QTUCS時(shí), 位于0.511 4 V處的氧化峰(峰電流為-0.397 7 mA)峰位正移至0.522 3 V處(峰電流為-0.341 4 mA), 位于0.227 5 V處(峰電流為0.400 4 mA)的還原峰峰位負(fù)移至0.173 5 V處(峰電流為0.394 8 mA)； 在加入2.4 mL QTUCS后, 氧化峰峰位正移至0.576 3 V處, 峰電流下降至-0.269 1 mA, 還原峰峰位負(fù)移至0.141 3 V處, 峰電流下降至0.323 9 mA. 因此, QTUCS使DNA/K4Fe(CN)6體系的式量電位增大, 峰電流下降, 且隨著QTUCS劑量的增大, 式量電位增大與峰電流下降的趨勢(shì)越來越明顯. 表明QTUCS與鯡魚精DNA之間存在嵌插作用.

圖7 QTUCS對(duì)DNA黏度的影響Fig.7 Effect of QTUCS on viscosity of DNA

2.2.3 黏度法 QTUCS對(duì)DNA黏度的影響如圖7所示. 由圖7可見, 在鯡魚精DNA中加入QTUCS后, 體系的相對(duì)黏度增大, 且隨著ρ(QTUCS)/ρ(DNA)值的增大, 鯡魚精DNA溶液黏度增大的趨勢(shì)越來越明顯, 即鯡魚精DNA黏度的增大程度與QTUCS劑量呈正相關(guān). 文獻(xiàn)[13]研究表明, 若產(chǎn)物與鯡魚精DNA的作用方式為嵌插作用, 則DNA的黏度增大, 可見QTUCS能嵌插到DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部, 增長了鯡魚精DNA分子的直鏈, 導(dǎo)致DNA溶液黏度增大. 因此可推斷, QTUCS與鯡魚精DNA間以嵌插方式相互作用.

綜上所述, 本文采用紫外-可見吸收光譜、熱重-差熱分析法對(duì)合成的QTUCS進(jìn)行了表征, 并通過紫外-可見吸收光譜、循環(huán)伏安法和黏度法研究了QTUCS與鯡魚精DNA的作用方式. 結(jié)果表明： 合成的QTUCS紫外-可見吸收光譜分別在213.5,280.0 nm處出現(xiàn)吸收峰； 其熱穩(wěn)定性較差, 在180 ℃開始氧化分解; QTUCS與鯡魚精DNA間主要以嵌插結(jié)合模式相互作用.