木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解制備綠豆多肽

吳卓夫, 李 萌, 張斯童, 陳 光

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 吉林省秸稈綜合利用技術(shù)創(chuàng)新平臺, 長春 130118)

綠豆分離蛋白經(jīng)水解后獲得的綠豆多肽具有抗氧化[1-3]、降血脂、降膽固醇[4]、降血壓[5-6]、改善動脈順應(yīng)性和內(nèi)皮功能[7]、防止肥胖[8]等功效. 作為天然抗氧化劑, 綠豆多肽能有效延長食物的儲存期. 綠豆多肽在生理上優(yōu)于完整的蛋白質(zhì), 更易于被人體有效吸收[9]. 綠豆多肽的生物學(xué)功能常受多肽中氨基酸序列組成和分子量、所用水解方法及肽回收方法的影響[10].

目前, 從綠豆分離蛋白制備綠豆多肽的主要方法是酸水解法. 酸水解法具有反應(yīng)高效、水解徹底、獲得的產(chǎn)品風(fēng)味極佳等優(yōu)點, 但在強(qiáng)酸(濃鹽酸)水解綠豆蛋白過程中, 易產(chǎn)生氯代醇(如3-氯-1,2-丙二醇(MCPD)和1,3-二氯-2-丙醇(DCP))等致癌物質(zhì)[11]. 采用酶水解法[12-13]更安全、溫和. 酶水解過程很少或無不良的副反應(yīng)發(fā)生， 不涉及化學(xué)藥品使用， 制備條件更安全， 產(chǎn)物中不含致癌物質(zhì)， 可產(chǎn)生特殊風(fēng)味的物質(zhì). 此外， 生化技術(shù)的發(fā)展也促進(jìn)了新的酶水解綠豆蛋白產(chǎn)品的研發(fā)[14].

木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶, 可水解絕大多數(shù)肽鍵, 但對不同肽鍵水解的速率相差較大, 該酶對蛋白質(zhì)或多肽中精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽鍵非常敏感[15-18]. 堿性蛋白酶是一種內(nèi)切蛋白酶, 該酶可特異性切割谷氨酰胺—組氨酸、絲氨酸—組氨酸、亮氨酸—酪氨酸、酪氨酸—蘇氨酸之間的肽鍵[19]. 此外, 堿性蛋白酶操作安全性較高, 符合多種機(jī)構(gòu)的食品級標(biāo)準(zhǔn)[20]. 由于木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶均有各自專屬的肽鍵切割位點, 其水解活力均較高, 因此可將這兩種酶組合使用, 以對綠豆分離蛋白進(jìn)行有效水解. 此外, 綠豆分離蛋白致密的分子結(jié)構(gòu)將對酶的水解產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性[4,21], 因而采用順序水解的方法實現(xiàn)綠豆蛋白的高效水解, 并在單因素實驗的基礎(chǔ)上, 利用正交實驗設(shè)計對堿性蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化, 為高效水解綠豆分離蛋白制備綠豆多肽提供理論依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 儀 器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-2-85-Ⅱ型, 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)； 高速粉碎機(jī)(RT-02型, 臺灣弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司)； 100目篩子(上虞市道墟儀器篩具廠)； 電子天平(AL204-IC型, 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司)； 磁力加熱攪拌器(CJJ-931型, 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)； 電熱恒溫水浴鍋(TDA-8002型, 天津市泰斯特儀器有限公司)； 精密pH計(E-201-C-9型, 上海越磁電子科技有限公司)； 恒溫震蕩搖床(KYC-100B型, 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)； 電磁爐(KLX-20型, 中山市科立信電子電器有限公司)； 臺式高速低溫離心機(jī)(D-37520型, 德國Sigma公司)； 冷凍干燥機(jī)(ALPHR1-4LSC型, 德國Christ公司)； 噴霧干燥機(jī)(MSD-1.0型, 德國Christ公司)； Millipore超濾系統(tǒng)(01730型, 上海艾研生物科技有限公司).

1.2 試 劑

綠豆(購于長春市某農(nóng)貿(mào)市場)； 堿性蛋白酶(上?？笊锛夹g(shù)有限公司)； 木瓜蛋白酶(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)； NaOH,HCl(分析純, 北京化工廠).

2 實 驗

2.1 綠豆分離蛋白的制備

用堿提酸沉法制備綠豆分離蛋白[22]: 先將綠豆用高速粉碎機(jī)研磨成60目的粉末， 再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的綠豆粉在水中用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=9.0, 10 ℃下與磁力攪拌器混合30 min. 為了增加蛋白的產(chǎn)量, 對殘余物進(jìn)行重復(fù)萃取, 離心合并提取物, 用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=4.5以沉淀蛋白質(zhì). 在10 ℃條件下, 離心10 min回收蛋白質(zhì), 用蒸餾水洗滌所得蛋白質(zhì)凝乳的表面. 將凝乳用蒸餾水重新分散, 再次離心, 最后冷凍干燥.

2.2 木瓜蛋白酶的水解

先用木瓜蛋白酶對綠豆分離蛋白進(jìn)行水解[23]: 配制適量的綠豆分離蛋白溶液, 調(diào)節(jié)pH=7.0； 再在45 ℃下, 加入適量的木瓜蛋白酶觸發(fā)水解反應(yīng)； 反應(yīng)4 h后, 將樣品置于沸水浴中15 min, 確保木瓜蛋白酶失活； 最后將上述綠豆蛋白水解液在室溫下冷卻, 置于4 ℃冰箱待用.

2.3 堿性蛋白酶水解條件的篩選

用堿性蛋白酶繼續(xù)水解上述樣品, 利用單因素實驗篩選水解體系的pH值、酶與底物的質(zhì)量比(E/S比)、水解溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素的最佳值.

1) 篩選水解體系pH值. 在保持綠豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%、溫度50 ℃、E/S比=7%的條件下, 考察水解體系pH=7.5,8.0,8.5,9.0,9.5時的水解度.

2) 篩選E/S比. 在保持水解體系pH=9.5、綠豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%、溫度50 ℃的條件下, 考察在E/S比為5%,6%,7%,8%,9%下的水解度.

3) 篩選水解溫度. 在保持水解體系pH=9.5、E/S比=8%, 綠豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的條件下, 考察溫度為45,50,55,60,65 ℃時的水解度.

4) 篩選綠豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù). 在保持水解體系pH=9.5、溫度55 ℃、E/S比=8%的條件下, 考察綠豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,6%,7%,8%,9%時的水解度.

先將水解后的樣品置于沸水浴中15 min, 以確保堿性蛋白酶徹底喪失活力, 再在室溫下冷卻, 離心收集上清液. 采用pH-stat法測定上清液中綠豆蛋白的水解度(degree of hydrolysis, DH)[24].

2.4 正交實驗優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件

基于單因素實驗結(jié)果, 利用4因素3水平正交實驗考察水解體系的pH值(A)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、酶與底物的質(zhì)量比(C)、水解溫度(D)對水解度的影響, 確定最佳水解條件， 結(jié)果列于表1.

表1 L9(34)正交實驗因素與水平

2.5 綠豆多肽的分離純化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的綠豆多肽水解液, 先將其透過截留分子量為5 000的超濾膜, 操作壓力為0.18 MPa, 再將濾過液透過截留分子量為1 000的超濾膜, 操作壓力為0.21 MPa, 最后利用考馬斯亮藍(lán)法測定不同截留組分中多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[25], 將分離后的綠豆多肽冷凍干燥.

3 結(jié)果與討論

3.1 pH值對水解度的影響

通常, 偏酸或偏堿的環(huán)境會破壞酶的空間構(gòu)象, 導(dǎo)致酶的可逆或不可逆變性, 從而影響酶的催化活力. pH值對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響如圖1所示. 由圖1可見： 當(dāng)水解體系的pH=7.5～9.5時, 水解度隨水解體系pH值的增加而逐漸增加； 當(dāng)水解體系的pH=9.5時, 水解度達(dá)最大, 與文獻(xiàn)[26]研究結(jié)果一致. 因此在后續(xù)的單因素實驗中, 選擇水解體系的pH值均為9.5.

3.2 E/S比對水解度的影響

圖1 pH值對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響Fig.1 Effects of pH values on kinetic curves of isolated mung bean protein by hydrolysis of alcalase

圖2 E/S比對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響Fig.2 Effects of E/S ratios on kinetic curves of isolated mung bean protein by hydrolysis of alcalase

E/S比對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響如圖2所示. 由圖2可見, 當(dāng)E/S比為5%～9%時, 水解度隨E/S比的增加而增加； 當(dāng)E/S比為9%時, 水解度達(dá)到最大. 在E/S比較低的情形下, 由于底物的可獲得性, 因此堿性蛋白酶最初攻擊在整個水解期間連續(xù)水解鍵中最敏感的肽鍵[27]. 隨著E/S比的增加, 堿性蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大, 水解速率加快. 當(dāng)E/S比大于8%時, 綠豆分離蛋白水解的趨勢變緩, 表明堿性蛋白酶自身可能發(fā)生了水解反應(yīng)[28]. 因此在后續(xù)單因素實驗中, 選擇E/S比為8%.

3.3 水解溫度對水解度的影響

溫度對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白水解動力學(xué)曲線的影響如圖3所示. 由圖3可見, 堿性蛋白酶在55 ℃下的水解度最高. 當(dāng)溫度較低時, 堿性蛋白酶與蛋白分子運動的速率均較低, 不利用堿性蛋白酶水解蛋白； 當(dāng)溫度較高時, 堿性蛋白酶部分失活, 導(dǎo)致活力損失[29]， 與文獻(xiàn)[30]的研究結(jié)果一致. 因此在后續(xù)的單因素實驗中, 選擇體系的溫度為55 ℃.

3.4 綠豆蛋白底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度的影響

底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響如圖4所示. 由圖4可見, 當(dāng)綠豆分離蛋白底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時, 水解度隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增加, 當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時, 水解率達(dá)到最大, 這是由于堿性蛋白酶與綠豆分離蛋白之間的接觸幾率增大[31]所致. 當(dāng)?shù)孜锏馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時, 水解度下降, 這是由于溶液黏度的增加影響了綠豆分離蛋白向堿性蛋白酶的擴(kuò)散[32]所致.

圖3 溫度對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白水解動力學(xué)曲線的影響Fig.3 Effects of temperatures on kinetic curves of isolated mung bean protein by hydrolysis of alcalase

圖4 底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白動力學(xué)曲線的影響Fig.4 Effects of mass fractions of substrate on kinetic curves of isolated mung bean protein by hydrolysis of alcalase

3.5 正交實驗

正交實驗結(jié)果列于表2, 其統(tǒng)計分析結(jié)果列于表3， 其中：k1，k2,k3分別為表2中A，B，C，D各因素對應(yīng)水平3個實驗結(jié)果之和的平均值，R為極差， 即k1，k2，k3中的最大數(shù)與最小數(shù)之差.

表2 正交實驗結(jié)果

表3 正交實驗結(jié)果統(tǒng)計分析

由表2可見: 各參數(shù)對堿性蛋白酶水解綠豆分離蛋白水解度的影響大小為B>D>C>A, 即綠豆蛋白底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)>水解溫度>E/S比>pH值； 最優(yōu)組合為B3D2C2A2, 即綠豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%, 水解溫度為55 ℃, E/S比為8%, pH=9.0. 在最佳水解條件下反應(yīng), 可獲得32.58%的水解度. 將胃蛋白酶、Flavourzyme蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶分別用于綠豆分離蛋白的水解中, 其水解度最高為28.82%[23]. 可見, 通過木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶之間的順序水解工藝可獲得較高的水解度.

綠豆分離蛋白水解液經(jīng)超濾分離后, 得到分子量>5 000的綠豆多肽約為10.08%, 分子量1 000～5 000的綠豆多肽約為3.27%, 分子量<1 000的綠豆多肽約為86.65%. 分子量<1 000的綠豆多肽能顯著激活乙醇脫氫酶的活力[33].

綜上所述, 本文利用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的順序水解工藝制備綠豆多肽, 優(yōu)化了反應(yīng)條件, 使綠豆蛋白的水解度達(dá)32.58%, 表明該水解工藝在制備綠豆多肽中具有一定的應(yīng)用前景.