天然復(fù)合面包發(fā)酵劑的制備與性能分析

吳佳靜，張娟*，李江華*，堵國成，陳堅，李志斌，傅貴華

1(江南大學，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 4 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)5(福建省麥都食品發(fā)展有限公司，福建 泉州，362200)

烘焙食品在我國食品工業(yè)中具有極其重要的地位，其產(chǎn)品消費市場巨大。近幾年，我國烘焙行業(yè)銷售額始終保持著10%以上的年增長率[1]。2016年，我國烘焙食品產(chǎn)業(yè)營收已經(jīng)突破千億大關(guān)，總利潤額達到 124.6 億，同比增長 31.2%[2]。面包在烘焙食品中始終占據(jù)較顯著的優(yōu)勢地位，也是烘焙食品中唯一需要使用發(fā)酵劑的主導(dǎo)產(chǎn)品，面團發(fā)酵的整個過程中均需要使用發(fā)酵劑[3]。

目前烘焙市場上普遍使用的即發(fā)活性干酵母，在面包中的使用弊端已逐步顯現(xiàn)。首先，普通干酵母中微生物種群單一，在產(chǎn)生酸類和酯類等揮發(fā)性風味物質(zhì)方面的能力較差，導(dǎo)致制作出的面包風味單一，口感不佳，且營養(yǎng)物質(zhì)含量較低；此外，普通干酵母面包易于老化掉渣，霉菌生長較快，往往需要添加化學防腐劑來延長貨架期[4]。天然復(fù)合發(fā)酵劑作為酸面團發(fā)酵這一歷史悠久的面包制作工藝的革新，因其制備的面包具有風味獨特[5-6]、營養(yǎng)價值高[7-10]、面包品質(zhì)好[9, 11]、貨架期長[12-14]等優(yōu)點，近年來日益受到消費者的認可和追捧。然而，由于該類產(chǎn)品往往面臨性能優(yōu)良的菌株少，活菌數(shù)較低，對面包發(fā)酵的貢獻有限，批次間菌群不穩(wěn)定[15-16]，制備的面包品質(zhì)和風味不穩(wěn)定等問題。相關(guān)產(chǎn)品長期以來始終集中在部分國外企業(yè)中，產(chǎn)品價格居高不下[17]，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高性能天然復(fù)合發(fā)酵劑在國內(nèi)市場鳳毛麟角，阻礙了高端健康面包品系的快速發(fā)展。

本研究利用前期篩選的優(yōu)良酵母菌與乳酸菌菌群，采用優(yōu)化策略制備烘焙性能及儲存特性穩(wěn)定的天然復(fù)合發(fā)酵劑，實現(xiàn)改善面包質(zhì)構(gòu)、增強面包風味、提高營養(yǎng)價值、化學防腐劑零添加等效能的健康面包生產(chǎn)，開辟了高端健康面包生產(chǎn)的新格局。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) WJ-03(保藏編號為CCTCC No: M 2016509)、乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis) WJ-01(保藏編號為CCTCC No: M 2016405)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) WJ-02(保藏編號為CCTCC No: M 2016406)，均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，為本課題組從葡萄天然發(fā)酵液中分離得到。

乳酸明串珠菌在GM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基中添加5 g/L的葡萄糖)中30 ℃靜置培養(yǎng)，植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)，釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基中30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

M17、MRS肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司；海藻糖，上海生工股份有限公司；脫脂奶粉，邁高乳業(yè)(青島)有限公司；抗壞血酸，國藥集團化學試劑有限公司；小麥粉，濱州中裕食品有限公司；即發(fā)高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；黃油，上海高夫食品有限公司；糖、鹽，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械研究所；真空冷凍干燥機(4K XL)，Virtis公司產(chǎn)品；冷凍立式離心機(CF16RX)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；SM-25攪拌機、SPC-40SP醒發(fā)箱、SM-523烤箱，無錫新麥機械有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS-QP2010，日本島津公司；Extrelut QE celite固相抽提柱、CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和乳酸菌凍干粉的制備

發(fā)酵劑中釀酒酵母占主導(dǎo)地位，且考慮實際生產(chǎn)應(yīng)用的需要，釀酒酵母、乳酸明串珠菌、植物乳桿菌采用課題組前期優(yōu)化后的相同復(fù)合凍干保護劑進行發(fā)酵劑制備，即凍干保護劑組分為海藻糖8%，抗壞血酸1.5%，脫脂奶粉10%；菌懸液和保護劑體積比為1∶0.6[18]。

將釀酒酵母、乳酸明串珠菌、植物乳桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)后期。離心取沉淀，無菌生理鹽水(0.85 g/L的NaCl溶液)洗2次。沉淀5倍濃縮于無菌生理鹽水中，加入保護劑溶液，平衡30 min，進行冰箱預(yù)凍(-80 ℃，12 h)，真空冷凍干燥(-50 ℃，13 Pa)得菌粉，并測定凍干存活率及活菌數(shù)[19]。

1.3.2 天然復(fù)合發(fā)酵劑菌種配比研究

復(fù)合發(fā)酵劑菌種配比m(釀酒酵母)∶m(乳酸明串珠菌)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4；m(釀酒酵母)∶m(植物乳桿菌)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。不同比例的菌粉添加量按照凍干后的每克活菌數(shù)計算。

以普通酵母(即發(fā)活性干酵母)面包為對照，不同面包的制作配方見表1。其中干酵母的添加量在預(yù)實驗基礎(chǔ)上以不影響面團正常醒發(fā)速度的最低添加量為準。

表1 普通酵母面包和復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵面包配方Table 1 Formula of common yeast bread and mixed starter bread

面包制作工藝：表1中干料混勻，加水慢攪1.5 min，快攪1.5 min，加入黃油，慢攪 1.5 min，快攪 2 min 至面團表面光滑，拉開成薄膜狀，室溫下覆膜靜置松弛 10 min。將面團分割為90 g/個，搓圓成型，于醒發(fā)箱內(nèi)(38 ℃，相對濕度 85%)醒發(fā)2 h，普通酵母發(fā)酵面團醒發(fā)1.5 h。醒發(fā)好的面團放入烤箱內(nèi)(上火 170 ℃，下火 210 ℃)烘烤 21 min[4]。

面包冷卻2 h后用油菜籽置換法測定比容[20]。

采用質(zhì)構(gòu)儀測定面包芯硬度。參數(shù)設(shè)置：探頭型號為P/36，測試前速率1.0 mm/s，測試速率3.0 mm/s，測試后速率3.0 mm/s，壓縮程度50%，感應(yīng)力5 g，2次壓縮間隔時間1 s[21]。

1.3.3 面包儲藏期內(nèi)老化特性測定

面包芯硬度測定：冷卻2 h的面包，密封好放置在4 ℃冰箱，采用CT3質(zhì)構(gòu)儀測定貯藏0、1、3、5、7 d的面包芯硬度變化。測試方法與參數(shù)設(shè)置同1.3.2。

面包老化焓值測定：將密封好的面包放置在4 ℃冰箱中，采用差示量熱掃描儀測定貯藏1、3、5、7 d的面包芯老化焓值。稱取10 mg樣品，升溫速率為5 ℃/min，掃描范圍為30～110 ℃[21]。

1.3.4 面包揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase microextraction-gas chromatographic-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技術(shù)分析面包中揮發(fā)性風味物質(zhì)。

頂空固相微萃取(SPME)：將面包分割為碎塊，稱取5 g置于 15 mL SPME 樣品瓶中，將萃取頭自樣品瓶的頂端插入，60 ℃恒溫水浴，頂空萃取 45 min，進樣。

色譜條件：J&W DB-WAX 石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱；升溫程序：恒定40 ℃，1 min后6 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至245 ℃，保持15 min；載氣為He；10 mL/min分流，分流比為12∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，進樣孔溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，激活電壓1.5 V 。采集方式為全掃描(SCAN)，質(zhì)量掃描范圍m/z33～495[21]。

揮發(fā)性風味化合物的定性定量：GC-MS 圖譜峰與標準譜庫(NIST 05)比對，設(shè)定匹配度和純度均大于 700 為鑒定結(jié)果?；衔锒浚喊捶迕娣e歸一化法計算相對含量。

1.3.5 天然復(fù)合發(fā)酵劑貨架期測定

分別取儲藏0、15、30、60、90 d的發(fā)酵劑，加入生理鹽水復(fù)水，測定存活率[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵劑菌種配比試驗

各菌株的凍干存活率及菌粉活菌數(shù)如表2所示。

表2 菌株凍干存活率及菌粉活菌數(shù)Table 2 Freeze-drying survival rate of strains and the viable bacteria of powder

為了探究釀酒酵母與乳酸菌的最適比例，首先進行釀酒酵母與單一乳酸菌雙菌復(fù)配的研究，繼而進行3菌復(fù)配研究，以得到最適復(fù)合發(fā)酵劑菌株配比。

2.1.1 兩菌復(fù)配對面包烘焙特性的影響

面包比容反映面團體積膨脹程度及保持能力，與面包品質(zhì)正相關(guān)；硬度是表征面包品質(zhì)最重要的質(zhì)構(gòu)參數(shù)之一，與面包品質(zhì)負相關(guān)[22]。比容、硬度直接影響到成品面包的外形、口感、組織，對面包的品質(zhì)往往有著決定性的影響。從圖1和圖2可見，發(fā)酵劑中添加了乳酸菌后，面包比容、硬度均優(yōu)于對照普通酵母面包，面包表面色澤更加均勻、金黃有光澤，切面氣孔更加均勻細密。兩菌復(fù)配面包的比容隨著乳酸菌添加量先增大后減小，在1∶2時均達到最大，分別為對照的1.13倍和1.14倍；面包硬度則隨著乳酸菌添加量先減小后增大，在1∶3時均達到最小，分別為對照的0.48倍和0.51倍。天然復(fù)合發(fā)酵劑中酵母菌產(chǎn)生CO2，主要影響面包體積，含有的乳酸菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境能激發(fā)面粉中的蛋白酶活性，促進蛋白水解，軟化面筋結(jié)構(gòu)，面包比容隨之增大；同時，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的靜電斥力增加，面筋中蛋白質(zhì)纏繞程度降低，從而降低面包硬度。但是當酸度過高時，蛋白酶的水解力過大，反而會破壞面筋結(jié)構(gòu)，對面包品質(zhì)產(chǎn)生不良影響[23]。不同乳酸菌復(fù)配比例的面包內(nèi)部結(jié)構(gòu)和色澤差異不明顯，但分別添加2種乳酸菌制備的面包香氣有明顯的差異，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，3菌復(fù)配發(fā)酵將會比兩菌復(fù)配產(chǎn)生更豐富的代謝產(chǎn)物，進一步提升面包的風味。因此，選擇釀酒酵母與乳酸明串珠菌比例及釀酒酵母與植物乳桿菌比例均為1∶2～1∶3，作為后續(xù)3菌復(fù)配試驗基礎(chǔ)。

A-面包比容；B-面包硬度；C-面包切片及表面圖圖1 不同比例釀酒酵母，乳酸明串珠菌復(fù)配面包的烘焙特性Fig.1 Baking characteristics of bread with different proportions of S. cerevisiae and L. lactis complexs

A-面包比容；B-面包硬度；C-面包切片及表面圖圖2 不同比例釀酒酵母，植物乳桿菌復(fù)配面包的烘焙特性Fig.2 Baking characteristics of bread with different proportions of S. cerevisiae, L. plantarum complexs

2.1.2 3菌復(fù)配對面包烘焙特性的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取釀酒酵母和乳酸菌比例為1∶2、1∶2.5、1∶3進行后續(xù)3菌復(fù)配研究，具體復(fù)配比例m(釀酒酵母)∶m(乳酸明串珠菌)∶m(植物乳桿菌)分別為1∶0.5∶1.5、1∶1∶1、1∶1.5∶0.5、1∶0.5∶2、1∶2∶0.5、1∶1∶2、1∶1.5∶1.5、1∶2∶1。

如圖3所示，不同3菌復(fù)配比例的發(fā)酵劑制備的面包，在內(nèi)部結(jié)構(gòu)和色澤方面沒有明顯的差別，而比容、硬度差別較明顯，說明不同乳酸菌添加量對于發(fā)酵劑的發(fā)酵性能影響顯著，適量乳酸菌的添加能較好的改善面包品質(zhì)。當釀酒酵母，乳酸明串珠菌和植物乳桿菌比例為1∶1.5∶1.5時，面包比容最大，約為對照(普通酵母面包)的1.15倍；面包硬度最小，約為對照的0.33倍，且均優(yōu)于2菌復(fù)配發(fā)酵面包的比容和硬度，以此比例為復(fù)合發(fā)酵劑菌株配比。

2.2 天然復(fù)合發(fā)酵劑對面包儲藏期老化特性的影響

硬度和老化焓是表征面包老化的重要指標[24]。由圖4可知，復(fù)合發(fā)酵劑和普通酵母(對照)制備的面包硬度和老化焓值均隨儲藏時間的延長而增加，面包整體品質(zhì)逐漸下降。在相同儲藏時間，復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵制備的面包硬度和老化焓值均低于對照組面包，RONDA[25]的研究結(jié)果顯示，淀粉重結(jié)晶是影響儲藏期內(nèi)面包芯硬度和老化焓變化的重要原因之一，乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸，促進淀粉酶水解支鏈淀粉，生成可溶性糊精，抑制淀粉回生[4]，減緩面包老化。

A-面包比容；B-面包硬度；C-面包切片圖；D-面包表面圖圖3 不同比例的3菌復(fù)配面包的烘焙特性Fig.3 Baking characteristics of bread with different proportions of three strains

圖4 復(fù)合發(fā)酵劑與普通酵母發(fā)酵劑面包儲藏期內(nèi)的硬度(A)和老化焓(B)Fig.4 Hardness and aging enthalpy of starter and common yeast starter bread during storage

2.3 天然復(fù)合發(fā)酵劑對面包風味的影響

分別將烘焙前的面團和烘焙后的面包，如表3所示，通過SPME-GC-MS分析揮發(fā)性風味物質(zhì)。

表3 用于SPME-GC-MS檢測的不同樣品Table 3 Different samples for SPME-GC-MS testing

在不同面團中，揮發(fā)性化合物種類差異較大。由圖5-A可見，對比普通酵母面團(面團1)，添加乳酸明串珠菌的面團(面團3)新出現(xiàn)了能帶來橙子、菠蘿、蘋果等果香和玫瑰香氣的乙酸癸酯、3-羥基-己酸甲酯、庚酸辛酯、己醛以及氰基乙酸等；添加植物乳桿菌的面團(面團4)中檢測到了能帶來香蕉、菠蘿、蘋果等果香的丁酸丙酯、己酸戊酯等物質(zhì)，以及戊酸、2-甲基-丁酸等有機酸。當面團中同時添加乳酸明串珠菌和植物乳桿菌(面團5)，面團中出現(xiàn)了能帶來香蕉、蘋果味的3-甲基-1-丁醇-乙酸酯，以及二乙基-乙酸、2-甲基-丁酸等，應(yīng)為多菌相互作用的結(jié)果。

圖5 面團(A)和面包(B)中的主要風味物質(zhì)聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of the main flavor in dough and bread

揮發(fā)性風味物質(zhì)面團1面團2面團3面團4面團5種類相對含量/%種類相對含量/%種類相對含量/%種類相對含量/%種類相對含量/%醇類1033.31127.571426.81137.311029.88酯類52.7344.06104.5963.6591.56酸類76.7785.7664.1379.0577.54酮類20.7231.1830.3310.7810.01醛類21.0810.2431.540010.01烴類61.7493.6387.47148.187.39雜環(huán)及含氮化合物、芳香族化合物40.2156.5130.2457.0340.52合計3646.554148.954745.14465.924046.91

表5 不同面包中所含風味物質(zhì)種類及相對含量統(tǒng)計Table 5 The flavor substances types and the relative content of different bread by statistic

如表5所示，醇類在面包中含量最高，是面包的重要風味物質(zhì)之一，通常具有芳香、植物香、酸敗和土氣味；乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸類物質(zhì)能使面包產(chǎn)生獨特的風味；酯類物質(zhì)則能為面包帶來果香和奶香[26]；酮類、醛類風味閾值較低，也是面包重要風味物質(zhì)之一[6]；烴類物質(zhì)風味閾值較高，對面包的整體風味貢獻較小[27]。不同面包中，風味物質(zhì)有較大差異，普通酵母面包(面包1)中檢出了45種風味物質(zhì)，而天然復(fù)合發(fā)酵劑面包(面包5)中檢出了56種，相對含量也提高了4.81%，說明天然復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵，增強了面包風味。由圖5-B可見，對比普通酵母面包(面包1)，添加乳酸明串珠菌的面包(面包3)中新出現(xiàn)了能帶來柑橘、杏子、菠蘿、蘋果等果香的丁酸癸酯、己酸戊酯，以及2-羥基-丙酸、3-甲基-丁酸等；添加植物乳桿菌的面包(面包4)中出現(xiàn)了能帶來果香味的1-己醇、丁酸-3-巰基己酯，以及乙酸、2-甲基-丁酸等。同時添加乳酸明串珠菌和植物乳桿菌(面包5)，面包中檢測出能賦予面包青草香味和果香味的1-己醇、丁醛，以及帶來奶酪味和水果香氣的2-甲基-丁酸等物質(zhì)，應(yīng)為多菌相互作用的結(jié)果。

高溫下的美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)對面包風味有重要貢獻，產(chǎn)物包括吡嗪、吡咯、呋喃等雜環(huán)及含氮化合物[28]。對比表4和表5，烘焙后面包中風味物質(zhì)種類增加，從圖5可知，普通酵母面包(面包1)比相應(yīng)面團1中新出現(xiàn)了能帶來濃郁奶酪香的3-羥基-2-丁酮和己醛、1-甲基環(huán)丙基-脲等物質(zhì)，而面團1中能帶來果香味的1-己醇、庚醛在烘焙后未檢測到；復(fù)合發(fā)酵劑面包(面包5)中也出現(xiàn)了3-羥基-2丁酮、己醛以及2-甲基-哌嗪、3-氨基甲基-4-甲基 -呋喃等，未檢測到相應(yīng)面團5中能帶來玫瑰香的苯乙醇，應(yīng)為高溫烘焙所致。

2.4 天然復(fù)合發(fā)酵劑貨架期測定

將復(fù)合發(fā)酵劑與普通酵母(對照)抽真空，置于4 ℃保存，儲藏期內(nèi)存活率變化見圖6。隨著儲藏時間的延長，釀酒酵母和植物乳桿菌下降幅度較小，而乳酸明串珠菌的存活率下降明顯，可能是由于采用的菌株為野生菌株，菌株耐性有待強化。但天然復(fù)合發(fā)酵劑在儲藏期內(nèi)整體總存活率下降緩慢，儲藏90 d后存活率仍有(81.78±4.05)%，儲藏穩(wěn)定性較好。

圖6 天然復(fù)合發(fā)酵劑與商業(yè)酵母發(fā)酵劑儲藏期存活率變化Fig.6 Survival rate variety of natural compound starter and commercial yeast starter storage in period

3 結(jié)論

發(fā)酵劑中活菌數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)直接影響面包品質(zhì)和風味。試驗結(jié)果表明釀酒酵母、乳酸明串珠菌和植物乳桿菌復(fù)配發(fā)酵有利于改善面包質(zhì)構(gòu)，增強風味，提升面包整體可接受度，不使用防腐劑而延長面包貨架期；且以1∶1.5∶1.5的比例復(fù)配時效果較好，在4 ℃儲藏有較好的穩(wěn)定性。本研究制備的天然復(fù)合發(fā)酵劑有利于促進高品質(zhì)健康烘焙食品的發(fā)展，為更多新型復(fù)合發(fā)酵劑的開發(fā)提供參考。