合成洋茉莉醛重組菌株的構(gòu)建與產(chǎn)物鑒定

劉思琴，鄭璞*，陳鵬程，鄧志敏，邢晨光，趙希景

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(廈門歐米克生物科技有限公司，福建 廈門, 361004)

洋茉莉醛(heliotropin)，又名胡椒醛，具有微甜的櫻桃和葵花香氣，還帶有微弱的辛香，香氣持久悠遠，是一種難得的香料[1]。洋茉莉醛在食用香料[2]、化妝品行業(yè)[3]、醫(yī)藥行業(yè)[3-5]、農(nóng)業(yè)[3-4]以及電鍍工業(yè)[1]上都有著廣泛的應用。天然洋茉莉醛主要存在于甜瓜、刺槐、香胡椒、香莢蘭豆等植物中，但含量極少[6]，人們無法從植物中直接提取獲得。

目前工業(yè)上洋茉莉醛的合成主要分為兩大類：一是以從植物中提取的黃樟油素、胡椒堿為原料的半合成法，其中前者應用更為廣泛，有報道其醛生成率高達96%[7-9]；二是采用完全由化學合成的鄰苯二酚、對甲基苯酚和香蘭素為原料的全合成法，在這3種底物中，以鄰苯二酚為原料的合成應用較為廣泛[7,10]，王帥等[11]以胡椒環(huán)與乙醛酸經(jīng)縮合得到的中間體3,4-亞甲二氧基苯乙醇酸為原料，產(chǎn)物收率高達93%。生物合成洋茉莉醛目前僅有極少量的報道。2003年，SANTOS等[12]篩選到能生成洋茉莉醛的菌株球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)，該菌株能夠在添加有H2O2的情況下，利用異黃樟素合成洋茉莉醛，其轉(zhuǎn)化率為4.74%。2004年，該課題組篩選到菌株宛氏擬青霉菌(Paecilomycesvariotii)，在同樣條件下，轉(zhuǎn)化率達到了20%，洋茉莉醛的含量為64 mg/L[13]。2017年，國內(nèi)趙明濤等[14]發(fā)現(xiàn)了1株液化沙雷式菌(Serratialiquefaciens)ZMT-1，能產(chǎn)282 mg/L洋茉莉醛。此外，RYU等[15]于2005年報道惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)JYR-1能將以反式茴香腦為代表的含有苯丙素類化合物轉(zhuǎn)化為相應的芳香醛或芳香酸類化合物。2012年該實驗室成功捕獲到催化這一類含有丙烯基苯類化合物的酶蛋白基因[16-17]，并認為該酶是一種新型的自給型黃素單加氧酶[18]，命名為Trans-Anethole Oxygenase(TAO)。

本文利用大腸桿菌異源表達來源于假單胞菌中的tao基因，獲得1株可異源表達TAO氧化酶的重組菌，該重組菌能氧化含有丙烯基苯類化合物的黃樟油素生成洋茉莉醛。同時優(yōu)化了重組菌株氧化酶的表達條件以及合成洋茉莉醛的反應條件，且對產(chǎn)物進行提取與鑒定。本文利用全細胞轉(zhuǎn)化法，產(chǎn)生的洋茉莉醛濃度為9.15 g/L，為迄今生物法合成洋茉莉醛報道的最高水平，具有良好的工業(yè)應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒

E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)、假單胞菌244以及質(zhì)粒pET-22b(+)均來自于作者實驗室保藏。

1.1.2 酶與試劑

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、 QuickCutEcoR Ⅰ、QuickCutNotⅠ、QuickCutXbaI、QuickCutXhoI均來自TaKaRa公司；柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、細菌基因組提取試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、引物的合成以及測序均來自生工生物工程(上海)股份有限公司；洋茉莉醛以及黃樟油素標準品由廈門嘉盟生物科技有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物 5，NaCl 10， pH值為7.0；TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油5，KH2PO417 mmol/L，K2HPO472 mmol/L，pH值為7.0 ；固體培養(yǎng)基在此基礎上添加1.5%瓊脂粉。

1.1.4 主要儀器

小型高速離心機，購自德國Eppendorf公司；臺式高速冷凍離心機，購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；721可見光分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；高效液相色譜，購自美國Waters公司；Amethst C18-H反向柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，購自美國賽分科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，購自美國尼高力儀器公司；全數(shù)字化核磁共振波譜儀，購自德國布魯克AXS有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的擴增及純化

1.2.2 表達載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物以及pET-22b(+)質(zhì)粒采用快切酶EcoRⅠ、NotⅠ同時進行雙酶切，并純化回收。將酶切的PCR產(chǎn)物和pET-22b(+)使用T4連接酶16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物導入到E.coliJM109的感受態(tài)中，42 ℃熱擊90 s，之后將其放入冰水中靜置2 min，加入1 mL LB培養(yǎng)基，于37 ℃，110 r/min培養(yǎng)1 h之后，將培養(yǎng)的菌體無菌離心，并將沉淀重懸于100 μL的LB培養(yǎng)基中，涂布于含有100 mg/L的氨芐霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取平板上的單菌落進行菌落PCR驗證。將獲得的菌體進行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET-22b(+)-tao進行雙酶切驗證，測序驗證。將測序正確重組質(zhì)粒pET-22b(+)-tao導入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于抗性平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，并進行菌落PCR驗證，挑取陽性克隆，得到重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)(tao)。

1.2.3 目的基因的誘導表達

挑取單菌落E.coliBL21(DE3)(tao)接種于含有100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)12 h。將種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接到含100 mg/L Amp的新鮮TB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min培養(yǎng)至菌體OD600值為0.6，加入終濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導6 h。通過測定酶活確定最佳IPTG使用量。在最佳IPTG的添加量下，以不同誘導溫度 20、25、30 ℃誘導6 h，收集菌液，測定酶活，確定最佳誘導溫度。在最佳誘導劑濃度、溫度條件下，分別誘導2、4、6、8、10 h，收集菌體，測定酶活，確定最佳誘導時間。在37 ℃培養(yǎng)不同時間后，以最佳IPTG濃度、溫度以及誘導時間培養(yǎng)收集菌體，測定酶活。確定重組菌最合適的誘導前培養(yǎng)時間。

1.2.4 洋茉莉醛的合成

收集誘導結(jié)束的重組菌菌體，作為生物催化劑，以黃樟油素為底物進行催化反應，合成洋茉莉醛。分別配制pH為3～5的50 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液；pH為6～8的50 mmol/L的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液；pH為9～11的50 mmol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。以上述緩沖液為反應體系緩沖液，測定反應中洋茉莉醛的濃度，計算其酶活并比較，確定最適的pH值。在最適反應pH條件下，測定在反應溫度為20、25、30、35、40 ℃的條件下，其酶活的大小，確定最適的反應溫度。在以最適的緩沖體系以及反應溫度的條件下，測定分別添加終濃度為1 mmol/L的Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Li+、Ni+、K+、Fe3+、Fe2+金屬離子對反應過程的影響，以確定在底物轉(zhuǎn)化的過程中，是否需要添加金屬離子。利用誘導結(jié)束的重組菌作為生物催化劑，在pH為8的磷酸緩沖液中，添加5%的濕菌體量，12 g/L黃樟油素，30 ℃條件進行轉(zhuǎn)化，分別在0、1、3、5、7、9 、11 h時取樣，測定洋茉莉醛的濃度變化。

1.2.5 酶活測定

反應體系為10 mL磷酸緩沖液(pH 7.4)：菌體OD600值為1，黃樟油素質(zhì)量濃度為1 g/L，30 ℃，110 r/min反應20 min，取出1 mL，加入1mL甲醇終止反應，充分混勻后，樣品采用0.45 μm的有機濾膜過濾，利用高效液相色譜法檢測洋茉莉醛含量。酶活單位(U)：在上述反應條件下，每1 h產(chǎn)生1 mmol洋茉莉醛所需要的酶量為1個酶活單位。

1.2.6 分析方法

轉(zhuǎn)化液中洋茉莉醛均采用Waters高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC)進行定量分析，使用2487紫外檢測器，1525泵組，2707自動進樣器。檢測條件為270 nm紫外檢測，柱溫箱為35 ℃，進樣量為10 μL。采用等度洗脫方式，流動相為60%乙腈，以及0.1%的甲酸，其他用超純水補充[19]。

1.2.7 洋茉莉醛的提取與鑒定

轉(zhuǎn)化液采用2倍體積的乙酸乙酯萃取，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，獲得洋茉莉醛固體。將獲得的固體溶解于水中，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶液。并將該溶液采用1.2.6中的HPLC方法進行測定，與洋茉莉醛標準品對比計算后，獲得產(chǎn)品純度P，按公式(1)計算：

(1)

式中：C1為測定的樣品質(zhì)量濃度；C2為配制的樣品質(zhì)量濃度。

同時利用紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)以及核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)鑒定，確定產(chǎn)品為洋茉莉醛。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

以提取的假單胞菌基因組為模板，采用引物taoF、taoD進行目的片段的調(diào)取與擴增，得到目的PCR產(chǎn)物，核酸電泳結(jié)果表示，目標條帶大約在1 000 bp，與已知的tao基因大小1 047 bp吻合，如圖1所示。

按照1.2.2的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-tao，具體見圖2。將上述獲得的重組質(zhì)粒導入到E.coliJM109的感受態(tài)中，經(jīng)菌落PCR驗證，挑取陽性克隆子并培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用XbaI以及XhoI進行雙酶切驗證，核酸電泳結(jié)果表示，目標條帶在1 000～2 000 bp，與已知大小1 060 bp位置相符合，其驗證結(jié)果如圖3所示。將驗證的重組質(zhì)粒進行測序驗證，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌株E.coliBL21(DE3)(tao)。

圖1 PCR擴增結(jié)果電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products

圖2 重組質(zhì)粒pET-22b(+)-tao的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-22b(+)-tao

圖3 pET-22b(+)-tao重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-22b(+)-tao by digestion with restriction endonuclease

2.2 重組TAO氧化酶表達條件的優(yōu)化

首先確定誘導劑IPTG的最適濃度，使IPTG濃度變化從0～0.6 mmol/L，收集菌體，測定酶活，發(fā)現(xiàn)隨IPTG濃度的增加，其酶活也在增加，當IPTG濃度為0.4 mmol/L時酶活達到最高，為19.8 U/g，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 IPTG濃度對酶活的影響Fig.4 Effect of IPTG concentration on enzyme activity

在一定范圍內(nèi)，過高的溫度導致蛋白表達過快，折疊出錯，形成包涵體，因此誘導溫度在蛋白表達過程中起關(guān)鍵性作用，根據(jù)圖5，在20～25 ℃之間，其酶活隨著溫度的增加只有略微的下降，范圍為30～33 U/g；而誘導溫度為30～35 ℃時，其酶活急劇下降，故適合的誘導溫度范圍為20～25 ℃。

圖5 不同誘導溫度對酶活的影響Fig.5 Effect of induction temperature on enzyme activity

誘導時長對酶活的影響如圖6所示。在誘導6 h時，酶活達到最高，為33 U/g。然而，在誘導至8 h時，其酶活僅僅降低了3 U/g，故后期的誘導時間在6～8 h均可。

圖6 誘導時間對酶活的影響Fig.6 Effect of induction time on enzyme activity

菌體前期培養(yǎng)時間不同，其生長狀態(tài)也不相同，在不同的菌體狀態(tài)下對其進行誘導。圖7結(jié)果顯示，菌體在培養(yǎng)70～90 min之間，即菌體OD600值為1.25～2(數(shù)據(jù)沒有顯示)進行誘導時，其酶活均在35 U/g左右，且相差不大，但在此范圍之前或之后誘導，其酶活均有明顯的下降，故可在轉(zhuǎn)接后于37 ℃下培養(yǎng)70～90 min之間進行誘導效果最佳。

圖7 菌體前期培養(yǎng)時間酶活的影響Fig.7 Effect of culture age on enzyme activity

故后期菌體的最佳培養(yǎng)條件是當菌體于37 ℃培養(yǎng)90 min時，添加終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導8 h，收集的菌體即可用于后期實驗。

2.3 洋茉莉醛的合成

由于反應體系的pH值直接影響到反應過程中的氧化酶的活性，故選擇pH值為3～11的緩沖液進行反應。由圖8可知，在pH值為7～9之間時，反應中酶活性表現(xiàn)較好，當pH值為8時達到最高，為35.04 U/g，即該酶的催化反應適合于偏堿性的緩沖體系，過酸與過堿均不利于酶的催化反應。

圖8 轉(zhuǎn)化pH對酶活的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

在溫度為20、25、30、35、40 ℃的條件下反應，當反應溫度為30 ℃時，酶活力表現(xiàn)最高，為35.3 U/g，當溫度提高35 ℃時，重組酶表現(xiàn)的活力并沒有減少過多，酶活依舊能夠達到30 U/g，但是當反應溫度提高到40 ℃時，酶的催化能力急劇下降，其酶活僅為15 U/g，結(jié)果如圖9所示。

同時，在反應過程中分別加入10種同濃度的金屬離子比較酶活，確定金屬離子是否對催化反應有影響，由圖10可知，Li+、K+對反應過程沒有影響，其酶活僅僅比空白對照高出1 U/g，Mn2+、Ca2+、Co2+、Fe3+、Fe2+有較弱的抑制作用，其表現(xiàn)出的酶活仍舊在30 U/g及以上，但是對于添加Cu2+、Ni+的反應過程中，對該酶反應的抑制較為明顯，添加Cu2+的反應過程，測定的酶活僅僅為3.9 U/g，總體而言，添加金屬離子對反應過程并沒有特別的促進作用，可在后期的反應過程中不添加。

圖9 轉(zhuǎn)化溫度對酶活的影響Fig.9 Effect of temperature on enzyme activity

圖10 金屬離子對轉(zhuǎn)化過程的影響Fig.10 Effect of metal ions on enzyme activity

跟蹤洋茉莉醛的合成過程見圖11，在5 h后，洋茉莉醛的合成量趨于平緩，質(zhì)量濃度達到最高為9.15 g/L，再經(jīng)過7 h的繼續(xù)轉(zhuǎn)化，洋茉莉醛的濃度以緩慢的速度降低。因此在后期的合成過程中需要進行隨時檢測，以防洋茉莉醛的進一步被氧化。

圖11 洋茉莉醛合成時間曲線Fig.11 Time curve of heliotropin production

2.4 產(chǎn)品的提取與鑒定

獲得的轉(zhuǎn)化液中含有高質(zhì)量濃度的洋茉莉醛，按1.2.7方法獲得的樣品見圖12，采用高效液相色譜測定其純度，計算得到洋茉莉醛樣品的純度為97%及以上。

圖12 提取的洋茉莉醛樣品Fig.12 Heliotropin products by extraction

圖13 洋茉莉醛樣品紅外鑒定圖Fig.13 Infrared spectrum of heliotropin

圖14為產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式以及其1H-MNR譜圖，根據(jù)圖數(shù)據(jù)分析，在δ= 9.813 ppm附近為9號位醛基氫的化學位移；δ= 7.426 ppm附近為苯環(huán)1號位氫的化學位移；δ= 7.337 ppm為2號位氫的化學位移；δ= 6.943 ppm為5號位氫的化學位移；δ= 6.078 ppm為10號位氫的化學位移；分析結(jié)果為該物質(zhì)為洋茉莉醛。

圖14 洋茉莉醛樣品核磁共振氫譜鑒定圖Fig.14 1H-NMR of heliotropin

3 結(jié)論

目前洋茉莉醛的生物合成仍在實驗階段，且研究較少，合成質(zhì)量濃度低于1 g/L，故生物法大量合成洋茉莉醛對其未來工業(yè)化生產(chǎn)具有較高的使用價值以及應用前景。本文成功構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)(tao)，通過優(yōu)化誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間以及誘導前菌體培養(yǎng)時間使重組菌的酶活達到35 U/g。重組菌合成洋茉莉醛的反應條件為pH為8，溫度為30 ℃，不添加金屬離子，反應時間5 h。合成洋茉莉醛的質(zhì)量濃度可達到9.15 g/L。通過乙酸乙酯萃取反應液得到洋茉莉醛晶體，純度為97%以上，經(jīng)紅外光譜和核磁共振波譜分析樣品為洋茉莉醛，因此該方法具有較好的工業(yè)應用價值。