運(yùn)動(dòng)干預(yù)高血壓小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中miR-143/145對蛋白激酶B信號的調(diào)節(jié)作用

廖靜雯 張琳 張嚴(yán)焱 葉芳 曾凡星 石麗君

1北京體育大學(xué)（北京 100084）

2廣州體育學(xué)院（廣州 510500）

運(yùn)動(dòng)對血壓的積極調(diào)控作用已經(jīng)得到廣泛的研究和認(rèn)可，各級血管形態(tài)和功能都會(huì)隨長期運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)適應(yīng)性變化，相比起大動(dòng)脈、毛細(xì)血管和各級靜脈，小動(dòng)脈即阻力血管的重塑在這個(gè)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[1，2]。小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作為動(dòng)脈血管壁的主要細(xì)胞類型，是決定血管反應(yīng)性和血管重構(gòu)的重要因素，其增殖、遷移、凋亡以及基質(zhì)成分合成是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)；VSMC在體內(nèi)外因素的影響下表現(xiàn)為不同的功能和分化階段，均涉及VSMC的表型轉(zhuǎn)換。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)調(diào)控高血壓小動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換尚未見報(bào)道，而多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以改善動(dòng)脈粥樣硬化大動(dòng)脈VSMC的功能并可能影響其表型[3-5]。在小動(dòng)脈的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性重塑過程中，VSMC表型調(diào)節(jié)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，即運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)高血壓動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)對動(dòng)脈形態(tài)和功能的積極影響進(jìn)而調(diào)控血壓。

微小RNA（mircroRNA，miRNA，miR）作為重要的表觀調(diào)控機(jī)制之一，為探究先天和后天因素相互作用提供了新契機(jī)，對關(guān)鍵miRNA進(jìn)行研究成為解釋高血壓的遺傳因素與生活方式（如運(yùn)動(dòng)）相互作用的良好切入點(diǎn)。miR-143/145在血管壁尤其是VSMC中大量表達(dá)，并且miR-143/145在正常血管壁的VSMC及處于分化狀態(tài)VSMC中表達(dá)最多[6]；大量離體和在體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)miR-143/145可維持VSMC收縮表型[7，8]。鑒于此，本研究假設(shè)長期有氧運(yùn)動(dòng)可能影響小動(dòng)脈中miR-143/145的表達(dá)，且其變化趨勢與運(yùn)動(dòng)后VSMC收縮表型成正相關(guān)，而與miR-143/145緊密相關(guān)的蛋白激酶B（Pro?tein kinase B，PKB，Akt）信號通路也可能在這個(gè)過程受到激活。

VSMC中Akt信號通路的激活也對收縮表型的VSMC起正向調(diào)控作用[9]；腫瘤相關(guān)研究報(bào)道，miR-143/145靶向于Akt通路上下游多個(gè)蛋白的mRNA，兩者間呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系[10，11]。故本研究推測，miR-143/145可能通過靶向Akt信號通路上多個(gè)蛋白來調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換；在特定的條件下（如高血壓），刺激因素（如運(yùn)動(dòng)）是否通過miR-143/145引起該通路中某一信號分子變化進(jìn)而使原本的調(diào)節(jié)機(jī)制被打破，成為本研究待解決的問題。

本實(shí)驗(yàn)對成年正常和高血壓大鼠分別進(jìn)行長期有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察運(yùn)動(dòng)改善高血壓癥狀的同時(shí)是否可以調(diào)節(jié)腸系膜動(dòng)脈VSMC的表型；檢測運(yùn)動(dòng)干預(yù)是否影響動(dòng)脈血管中miR-143/145的表達(dá)，觀察Akt信號通路主要蛋白的激活情況，并結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)對腸系膜動(dòng)脈VSMC分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染干預(yù)，以進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3月齡正常大鼠（Wistar Kyoto rats，WKY）和原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號為11400700074310，使用許可證號為SCXK（京）2012-0001，SHR和WKY各分為安靜對照組（WKY-C和SHR-C）和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組（WKY-E和SHR-E），每組20只，每籠4只。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食和飲水。清潔級動(dòng)物飼養(yǎng)房溫度為20～25℃，相對濕度為45%～55%，晝夜12/12小時(shí)照明。

1.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

各組大鼠先進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后，運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周的正式有氧跑臺(tái)訓(xùn)練（速度為20 m/min，坡度為0，每周5天，每天60 min），運(yùn)動(dòng)方案參考文獻(xiàn)[12，13]中遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練及在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對大鼠最大攝氧量的測定，訓(xùn)練強(qiáng)度相當(dāng)于55%～65%VO2max。安靜對照組大鼠于各籠內(nèi)飼養(yǎng)8周，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。分別于正式運(yùn)動(dòng)干預(yù)前及取材前對各組大鼠進(jìn)行血壓和心率的測量，具體方法參照以往的研究[14]。

1.3 HEHE染色

大鼠麻醉后取腸系膜動(dòng)脈（2～3級）剝離粘連組織后經(jīng)固定脫水后溶于石蠟，切片脫蠟后用蘇木素和伊紅染色，封片并拍攝。每個(gè)樣本組織切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行測量。

1.4 Western blot blot

取腸系膜動(dòng)脈充分裂解液，采用BCA測試方法對蛋白濃度進(jìn)行測定。采用SDS-PAGE電泳對蛋白進(jìn)行分離，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，與一抗（抗體α-actin和OPN購自Abcam;抗體GAPDH和calponin購自San?ta Cruz；抗體Akt和p-Akt購自Cell signal）和二抗（均購自Jackson ImmunoResearch）先后結(jié)合，采用ECL發(fā)光試劑反應(yīng)液與膜上的目的蛋白反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad，ChemiDoc? XRS+System）中進(jìn)行拍攝。利用Image Lab軟件對拍攝出的條帶影像進(jìn)行分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR

大鼠腸系膜動(dòng)脈采用miRcute miRNA提取分離試劑盒（TIANGEN，DP501），按照說明書步驟進(jìn)行操作，并運(yùn)用酶標(biāo)儀對總RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測。反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo Scientific，K1622），按照說明書步驟進(jìn)行操作。mRNA采用通用引物，miRNA及其對應(yīng)的內(nèi)參U6應(yīng)用特異性莖環(huán)引物（miR-145：5’-GTCGTATC?CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA?CGAAGGGATTC-3’；miR-143：5’-GTCGTATCCAGTG?CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGATGAG?CTAC-3’；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA擴(kuò)增采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Applied biosystems，4367218）進(jìn)行反應(yīng)，按照說明書步驟進(jìn)行操作。胰島素樣生長因子I受體（insulin-like growth factor I re?ceptor，IGF-1R）擴(kuò)增引物為：5’-GATGGAGGAGGTGA?CAGGAA-3’和5’-GTGGAGGTGAAACGGAGAAC-3’；胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-1）擴(kuò)增引物為：5’-AGGCACCATCTCAACAATC-3’和5’-GTTTCCCACCCACCATACTG-3’；p70核蛋白體S6激酶（p70 ribosomal S6 kinase，p70S6K）擴(kuò)增引物為：5’-GGTGGAGTCTGGGAGCATTA-3’和 5’-TGTGAGG?TAGGGAGGCAAAT-3’；GAPDH 擴(kuò)增引物為：5’-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3’和 5’-GAT?GACCTTGCCCACAGCCTTG-3’。miR-145擴(kuò)增引物為：5’-GACCAGTCCAGTTTTCCCAG-3’和 5’-TCG?TATCCAGTGCAGGGTC-3’；miR-143擴(kuò)增引物為：5’-ACGAGATGAGATGAAGCACT-3’和 5’-TCGTATC?CAGTGCAGGGTC-3’；U6擴(kuò)增引物為：5’-CTC?GCTTCGGCAGCACATATACT-3’和5’-ACGCTTCAC?GAATTTGCGTGTC-3’。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，獲得Ct值，計(jì)算△△Ct=（Ct實(shí)驗(yàn)組待測基因－Ct實(shí)驗(yàn)組參照基因）－（Ct對照組待測基因－Ct對照組參照基因），目的基因的相對表達(dá)量為2-△△Ct。

1.6 VSMCVSMC培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用酶分離法分離雄性Wistar大鼠（8～12周齡）腸系膜動(dòng)脈VSMC，方法參照文獻(xiàn)[15]。將原代VSMC用含有10%胎牛血清和1%雙抗（penicillin/streptomycin）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)培養(yǎng)皿中VSMC密度達(dá)80%～90%時(shí)用胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）進(jìn)行消化并傳代，VSMC至4～7代且細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine RNAiMAX 試劑（Invitrogen）將各miRNA干擾序列轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)：miR-145 mimic組，miR-145 inhibitor組，空脂質(zhì)體negative control（NC）組。miR-145 mimic（雙鏈）序列為5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’和 5’-GGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU-3’；miR-145 inhibitor（單鏈）序列為5’-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3’。 蛋白指標(biāo)于轉(zhuǎn)染后24 h，48 h，72 h和 96 h進(jìn)行檢測，各mRNA于轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h和72 h進(jìn)行定量。

1.7 VSMCVSMC免疫熒光染色與激光共聚焦成像

吸走培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，VSMC于4%多聚甲醛中固定，用0.2%Triton X-100孵育細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜穿孔，PBS漂洗后用5%BSA對非特異性結(jié)合抗體部位進(jìn)行封閉。以PBS稀釋一抗actin（1︰200），對細(xì)胞進(jìn)行4℃孵育過夜，用PBS漂洗后以PBS稀釋二抗（1︰1000）對細(xì)胞進(jìn)行孵育，PBS漂洗后滴加封片劑以蓋玻片封片。24 h內(nèi)運(yùn)用激光共聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)行信號捕捉與成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)輸入及計(jì)算采用SPSS16.0軟件。得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；在體實(shí)驗(yàn)組間比較采用單因素方差分析，各組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)，干預(yù)前后各組血壓數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；離體實(shí)驗(yàn)對觀測點(diǎn)的多重比較采用LSD方法分析。顯著性檢驗(yàn)水平以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后大鼠血壓和心率的變化

干預(yù)后，WKY-E組大鼠SBP顯著小于WKY-C組（P＜0.05）；SHR-E組SBP非常顯著小于SHR-C組（P＜0.01）；SHR-E組SBP與8周運(yùn)動(dòng)前比也顯著下降（P＜0.05）；SHR-E組DBP和MAP也顯著低于SHR-C組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓和心率比較（n=20）

2.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠腸系膜動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

WKY-E組與WKY-C組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)徑間無顯著差異，SHR-E組動(dòng)脈內(nèi)徑與SHR-C組相比有升高的趨勢但無顯著差異；WKY-E組與WKY-C組動(dòng)脈壁厚無顯著差異，SHR-E組動(dòng)脈壁厚顯著小于SHR-C組（P＜0.05）；動(dòng)脈壁厚/內(nèi)徑比值，雖然SHR-E組相比SHR-C組下降但未見顯著差異。見圖1。

圖1 運(yùn)動(dòng)對腸系膜動(dòng)脈形態(tài)的影響（n=6）

2.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠腸系膜動(dòng)脈VSMCVSMC表型標(biāo)志蛋白的變化

α-actin在WKY-C組和WKY-E組間無顯著差異，SHR-C組α-actin表達(dá)顯著低于WKY-C組，而SHR-E組α-actin表達(dá)與SHR-C比雖然有所升高但未見顯著性差異（圖2A）。WKY-E組calponin表達(dá)與WKY-C比未見顯著性差異，SHR-C組與WKY-C組比其calponin表達(dá)顯著降低，SHR-E組calponin表達(dá)顯著高于SHRC組（P＜0.05）（圖2B）。WKY-C組和WKY-E組OPN呈現(xiàn)低表達(dá)且兩組間未見顯著性差異，SHR-C組OPN表達(dá)顯著高于WKY-C組，SHR-E組OPN顯著低于SHRC組（P＜0.05）（圖2C）。

圖2 運(yùn)動(dòng)對平滑肌表型標(biāo)志蛋白的影響（n=12）

2.4 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠腸系膜動(dòng)脈miR-miR-143143和miR-miR-145145表達(dá)的變化

WKY-C組和WKY-E組miR-145表達(dá)無顯著差異，SHR-C組miR-145表達(dá)顯著低于WKY-C組（P＜0.01），SHR-E組miR-145表達(dá)顯著高于SHR-C組（P＜0.01）。miR-143在WKY-C和WKY-E間也未見顯著差異，SHR-C組miR-143表達(dá)顯著低于WKY-C組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 運(yùn)動(dòng)對腸系膜動(dòng)脈miR-145和miR-143表達(dá)的影響（n=12）

2.5 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠腸系膜動(dòng)脈AktAkt信號通路的激活

SHR-C組Akt磷酸化程度較WKY-C被顯著抑制（P＜0.01），SHR-E組Akt信號活性增強(qiáng)，與SHR-C比有顯著性差異（P＜0.05）（圖4）。

2.6 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后α -actinactin表達(dá)的變化

與原代分離VSMC相比，經(jīng)過傳代后的VSMC內(nèi)α-actin表達(dá)減少且呈現(xiàn)的絲狀結(jié)構(gòu)也減少，細(xì)胞呈多邊形；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后，miR-145過表達(dá)使VSMC中α-actin表達(dá)明顯增多且細(xì)胞呈梭形，甚至出現(xiàn)了α-actin的絲狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)在其收縮功能結(jié)構(gòu)在形態(tài)上增強(qiáng)；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后VSMC依然保持較低的α-actin表達(dá)量，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)不明顯，沒有明顯細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（圖5A）。

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后收縮表型標(biāo)志蛋白α-actin在12 h顯著增加（P＜0.01），在24 h達(dá)到峰值，與NC組比有非常顯著性差異（P＜0.01），在48 h后恢復(fù)正常水平；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后αactin表達(dá)在24 h顯著降低（P＜0.01）后逐漸恢復(fù)。VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾miR-145表達(dá)后，其收縮表型標(biāo)志蛋白α-actin表達(dá)均有明顯地改變（圖5B）。

圖4 運(yùn)動(dòng)對腸系膜動(dòng)脈Akt磷酸化的影響（n=12）

圖5 VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后α-actin的相對表達(dá)情況（n=3）

2.7 VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后AktAkt磷酸化表達(dá)變化

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic使之過表達(dá)后顯著抑制了Akt磷酸化（P＜0.01），使Akt在12 h即非常顯著降低，在24 h達(dá)到最低值后抑制效果持續(xù)至48 h，在72 h Akt磷酸化程度恢復(fù)正常；VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后，Akt受miR-145的抑制效果被顯著解除，Akt活性在轉(zhuǎn)染后12 h顯著升高（P＜0.05），持續(xù)到48 h其活性出現(xiàn)峰值后到72 h恢復(fù)正常水平。VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾miR-145后，Akt活性具有顯著性變化，miR-145與Akt呈明顯的負(fù)向調(diào)控關(guān)系（圖6A）。

2.8 VSMCVSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后AktAkt下游分子 mRNAmRNA表達(dá)變化

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic后miR-145的過表達(dá)顯著抑制了IGF-1R mRNA的含量，在12 h出現(xiàn)最低值后逐漸恢復(fù)，在48 h依然顯著低于正常水平（P＜0.01）；IRS-1 mRNA表達(dá)在12 h受抑制顯著降低（P＜0.01），后逐漸恢復(fù)，在24 h達(dá)到正常水平；而p70S6KmRNA在48h出現(xiàn)顯著下降并與NC比有非常顯著差異（P＜0.01），后恢復(fù)正常水平（圖6B、C、D）。

VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后，IGF-1R mRNA表達(dá)在24 h顯著升高（P＜0.01），IRS-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01），在24h顯著高于NC并在72h達(dá)到峰值，p70S6KmRNA表達(dá)在72 h內(nèi)未出現(xiàn)顯著改變（圖6）。

圖6 VSMC經(jīng)轉(zhuǎn)染后Akt磷酸化及其下游信號分子mRNA表達(dá)情況（n=3）

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對血壓和小動(dòng)脈血管形態(tài)的影響

中低強(qiáng)度長期有氧運(yùn)動(dòng)常作為干預(yù)高血壓的方法，其有效性、安全性、低成本和可實(shí)施性在研究和實(shí)際運(yùn)動(dòng)中也最為廣泛。本實(shí)驗(yàn)采用8周中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練對正常大鼠和高血壓大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)并觀察其血壓變化，結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠與運(yùn)動(dòng)前比SBP顯著下降，與安靜組比SBP、DBP和MAP均下降，即該有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著緩解SHR的高血壓癥狀。

小動(dòng)脈的重構(gòu)在運(yùn)動(dòng)干預(yù)高血壓中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，長期運(yùn)動(dòng)后小動(dòng)脈形態(tài)通過一系列適應(yīng)性變化降低了外周阻力并增加了血管的反應(yīng)性而最終起到降低血壓的作用。本研究選取大鼠腸系膜動(dòng)脈為組織材料進(jìn)行研究，因其為小動(dòng)脈肌性阻力血管，中膜平滑肌細(xì)胞豐富，符合本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。本結(jié)果中高血壓運(yùn)動(dòng)組大鼠腸系膜動(dòng)脈形態(tài)未出現(xiàn)明顯適應(yīng)性變化，其中動(dòng)脈內(nèi)徑有所增大但并不顯著，壁厚顯著下降，動(dòng)脈壁厚與內(nèi)徑的比值也未有顯著差異，說明本實(shí)驗(yàn)中有氧運(yùn)動(dòng)可以使小動(dòng)脈形態(tài)發(fā)生改變但并不顯著。以往研究中，高血壓動(dòng)物模型經(jīng)過長期運(yùn)動(dòng)后動(dòng)脈血管形態(tài)有明顯改變或血管并未發(fā)生重構(gòu)均有報(bào)道[13]，其原因可能為：運(yùn)動(dòng)所致的血管形態(tài)變化是一個(gè)循序漸進(jìn)積累的過程，細(xì)胞功能的改變可能早于血管的整體形態(tài)；研究表明，運(yùn)動(dòng)可有效改變腸系膜動(dòng)脈的收縮功能[16，17]。另外，由于腸系膜動(dòng)脈由腹腔動(dòng)脈分支后繼續(xù)分支為各級動(dòng)脈，這一因素使樣本取材過程中存在一定的誤差，這也是導(dǎo)致各研究結(jié)果差異的原因。盡管大部分研究支持運(yùn)動(dòng)員動(dòng)脈血管內(nèi)徑與缺少體力活動(dòng)的人有差異[18，19]，然而不同的運(yùn)動(dòng)模式（如耐力運(yùn)動(dòng)、力量練習(xí)或兩者結(jié)合鍛煉）是否會(huì)影響動(dòng)脈的形態(tài)變化尚不清楚，這可能是由于不同的動(dòng)脈血管檢測部位及不同的運(yùn)動(dòng)模式造成的。各級血管對于長期運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性重構(gòu)具有較大差異；并且，血管重構(gòu)更易發(fā)生于外周小動(dòng)脈及常暴露于血流和剪切力變化的血管中。

3.2 運(yùn)動(dòng)對小動(dòng)脈VSMCVSMC表型轉(zhuǎn)換的影響

機(jī)體各級動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)特性相差很大，中小動(dòng)脈為肌性動(dòng)脈，管壁內(nèi)彈性膠原逐漸減少而VSMC較多，細(xì)胞外基質(zhì)相對較少，發(fā)揮了控制血壓和調(diào)節(jié)血液分配的作用。小動(dòng)脈因體內(nèi)外因素發(fā)生重構(gòu)的過程中，VSMC形態(tài)和功能的變化（如表型轉(zhuǎn)換）對血壓的調(diào)節(jié)可能發(fā)揮了重要作用。本研究顯示，運(yùn)動(dòng)對正常血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈VSMC表型未見顯著性影響，正常和高血壓大鼠動(dòng)脈中VSMC表型有顯著差異，而運(yùn)動(dòng)可以有效調(diào)節(jié)VSMC表型，促進(jìn)SHR大鼠動(dòng)脈VSMC維持收縮表型。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)高血壓小動(dòng)脈VSMC表型尚未見報(bào)道；在相關(guān)心血管病癥的運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，運(yùn)動(dòng)確實(shí)調(diào)節(jié)了動(dòng)脈VSMC表型。Jordao等研究發(fā)現(xiàn)，12周低強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練可以使SHR胸主動(dòng)脈I型和III型膠原纖維mRNA表達(dá)降低，防止血管內(nèi)彈性膜破裂；運(yùn)動(dòng)還使大動(dòng)脈的形態(tài)、α-actin、彈性蛋白和膠原蛋白mRNA表達(dá)趨于正常，使VSMC在血管中定向分布[4]。Wamhoff等[5]對雌性小型豬進(jìn)行16周遞增跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)長期的有氧運(yùn)動(dòng)可以減弱有絲分裂原引起的冠狀動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換即保持具有維持血管收縮功能的收縮表型。Simmons等[20]對高膽固醇血癥的豬實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行16～20周的中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練，其通過對Akt、HSP90、Catalase等進(jìn)行蛋白含量檢測結(jié)合判斷VSMC表型，發(fā)現(xiàn)其冠狀動(dòng)脈中VSMC表型未見顯著性改變。Bowles等[21]證明運(yùn)動(dòng)可以改善冠狀動(dòng)脈VSMC中鈣離子依賴的基因轉(zhuǎn)錄并激活細(xì)胞膜鉀離子通路，維持VSMC穩(wěn)定的收縮表型。以上結(jié)果的差異可能是由于所選擇的判定蛋白的不同所導(dǎo)致的；另外，不同動(dòng)物模型及干預(yù)方式不具備可比性且檢測血管部位的不同都是造成結(jié)果差異的因素。綜上所述，運(yùn)動(dòng)對高血壓小動(dòng)脈VSMC表型具有調(diào)節(jié)作用，維持其具有功能性的收縮表型。

3.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)VSMCVSMC表型中miR-miR-145145對AktAkt信號通路的調(diào)控關(guān)系

miRNA已在高血壓和VSMC表型間建立了聯(lián)系，但文獻(xiàn)中對于miRNA在運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)高血壓血管功能中的作用鮮有報(bào)道，運(yùn)動(dòng)對VSMC表型轉(zhuǎn)換中關(guān)鍵miR?NA的影響尚屬空白。miR-143和miR-145作用共享一個(gè)初始轉(zhuǎn)錄本，發(fā)揮類似的作用，故許多研究中也把兩者miR-143/145放在一起討論。動(dòng)物和離體實(shí)驗(yàn)均證明miR-143/145可以使VSMC維持收縮表型，促進(jìn)其分化并抑制其增殖[22，23]。本研究顯示，運(yùn)動(dòng)可以改變高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈中miR-145的表達(dá)并促進(jìn)其增加，而miR-143表達(dá)未明顯受到運(yùn)動(dòng)的影響，miR-145對于運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性表達(dá)變化可能比miR-143更加靈敏。運(yùn)動(dòng)后miR-145表達(dá)的升高與小動(dòng)脈中VSMC收縮表型標(biāo)志蛋白的升高一致，說明運(yùn)動(dòng)引起的miR-145的改變可能參與了VSMC收縮表型的維持。以往研究也顯示，miR-143在調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)換中的作用不如miR-145明顯，主要表現(xiàn)為miR-143基因敲除小鼠較miR143/145及miR-145基因敲除小鼠血管結(jié)構(gòu)和收縮功能改變并不明顯[24，25]；另外，miR-145在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向VSMC分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，而miR-143并沒有明顯作用[26]。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡；Akt位于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐部位，是該通路下游的一種重要效應(yīng)分子。大量研究已證明，VSMC在保持分化狀態(tài)即維持其收縮表型中依賴于Akt通路，且其絲氨酸473位點(diǎn)（Ser 473）磷酸化程度決定了其激活狀態(tài)并與VSMC分化標(biāo)志蛋白成正相關(guān)[9]；高血壓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證明Akt信號的激活可以使VSMC保持分化，即維持VSMC的收縮表型[27]。在Akt信號通路的上下游存在著反饋調(diào)節(jié)，如在胰島素敏感的組織中（如骨骼肌和脂肪細(xì)胞），Akt下游mTOR和p70S6K可以通過抑制Akt上游IRS-1磷酸化來對該通路進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)[28，29]，用雷帕霉素抑制mTOR和p70S6K的表達(dá)可以釋放其對IRS-1的抑制從而激活A(yù)kt信號，這樣的調(diào)節(jié)機(jī)制在糖尿病患胰島素抵抗[30]和VSMC表型轉(zhuǎn)換[31]中都得到了證實(shí)。長期運(yùn)動(dòng)影響血管中Akt表達(dá)在文獻(xiàn)中只有少量報(bào)道，Li等[32]發(fā)現(xiàn)12周抗阻訓(xùn)練可以激活大鼠主動(dòng)脈中Akt信號的活性，起到對抗氧化應(yīng)激和保持血管的作用；Wang等[33]在心肌缺血所致的外周血管阻力增大模型中發(fā)現(xiàn)，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以使大鼠腸系膜動(dòng)脈中PI3K、Akt等信號激活，使該通路活性趨于正常。然而，Akt在長期有氧運(yùn)動(dòng)后對小動(dòng)脈VSMC的作用尚未見報(bào)道。本研究顯示，高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈中Akt信號活性被明顯抑制，而運(yùn)動(dòng)可以激活動(dòng)脈中Akt信號的活性，高血壓小動(dòng)脈中Akt信號在運(yùn)動(dòng)后被激活與VSMC收縮表型的維持和miR-145表達(dá)的提高相一致。然而，在癌癥腫瘤相關(guān)研究中，miR-145與Akt信號通路存在負(fù)調(diào)控關(guān)系[34-36]，故在各組織中miR-145與Akt信號通路可能形成網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)來發(fā)揮重要的生理與病理功能。

在心血管疾病中，miR-143/145對VSMC表型及Akt的研究只有個(gè)別報(bào)道，如Riches等離體培養(yǎng)VSMC發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-143/145可以使Akt上游IGF-1R蛋白表達(dá)增加，然而抑制miR-143/145并不會(huì)使IGF-1R減少[8]，推測miR-143/145對IGF-1R的影響可能受到其它反饋調(diào)節(jié)的控制。在不同病理情況下的病理組織中（如癌癥高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等），miR-143/145可能呈現(xiàn)截然不同的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制。在VSMC中miR-143/145與Akt信號間尚未明確建立調(diào)節(jié)關(guān)系，由于miRNA的多靶點(diǎn)效應(yīng)和Akt信號通路的網(wǎng)絡(luò)式反饋調(diào)節(jié)使得兩者在VSMC生理和病理過程中的相互作用更為復(fù)雜；miR-143/145可能同時(shí)作用于Akt上下游信號分子的mRNA，而Akt信號的一個(gè)效應(yīng)分子的激活或抑制可能被其它效應(yīng)分子的作用所掩蓋或代償。

故本研究選擇在離體培養(yǎng)的VSMC中對miR-145進(jìn)行干擾，明確其與Akt信號的調(diào)節(jié)關(guān)系。轉(zhuǎn)染miR-145 mimic使miR-145在增殖至4～7代的VSMC中過表達(dá)，VSMC中收縮表型標(biāo)志蛋白表達(dá)增加而合成表型標(biāo)志蛋白表達(dá)減少，且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞呈梭形；而轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor后VSMC中α-actin表達(dá)減少，VSMC向合成形態(tài)轉(zhuǎn)換。α-actin作為重要的VSMC表型標(biāo)志蛋白和細(xì)胞骨架功能蛋白，其高表達(dá)對于肌細(xì)胞保持收縮能力是必須的；Xin等[24]證明，敲除Dicer的小鼠由于全身性缺乏mRNA使其VSMC中actin整體骨架蛋白嚴(yán)重受損，而miR-145在小鼠內(nèi)過表達(dá)后可以明顯緩解其VSMC中骨架蛋白的受損，這個(gè)過程與miR-145參與actin的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，在VSMC中miR-145過表達(dá)分別抑制了IGF-1R和IRS-1 mRNA，同時(shí)Akt磷酸化程度降低；當(dāng)VSMC中miR-145表達(dá)減少時(shí)，IGF-1R和IRS-1 mRNA的抑制作用解除并出現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)Akt活性也被激活。說明miR-145可分別靶向于Akt信號通路上游IGF-1R和IRS-1 mRNA，通過抑制其表達(dá)進(jìn)一步抑制Akt信號的激活；然而，運(yùn)動(dòng)干預(yù)后高血壓動(dòng)脈VSMC中miR-145和Akt均被激活，推測運(yùn)動(dòng)后miR-145維持VSMC的收縮表型可能并不經(jīng)過Akt通路的激活。另外，研究證實(shí)Akt在調(diào)節(jié)VSMC表型的過程中其上下游間存在著反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，即Akt上游IGF-1R和IRS-1被磷酸化激活后可以使Akt活性增強(qiáng)進(jìn)而激活mTOR/p70S6K，然而p70S6K的過度活化可以反過來抑制IGF-1R和IRS-1信號向下轉(zhuǎn)導(dǎo)，故而形成一個(gè)反饋環(huán)[31]。在有限的VMSC相關(guān)研究中，Riches等對從二型糖尿病患者隱靜脈分離的VSMC進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pre-miR-145可以使IGF-1R蛋白表達(dá)增加，然而抑制miR-145并不會(huì)使IGF-1R減少[8]。人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株研究中，Akt通路的阻斷劑并不能減輕牽張力所致的miR-145抑制，即牽張力并不通過Akt通路發(fā)揮其對miRNA的抑制作用[23]。結(jié)合本研究結(jié)果及以往研究報(bào)道中miR-145對Akt通路的靶向關(guān)系可以推測，miR-145與Akt通路的相互關(guān)系可能受到復(fù)雜反饋調(diào)節(jié)的控制。在不同的體內(nèi)外因素刺激下（如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、運(yùn)動(dòng)等），二者可能呈現(xiàn)截然不同的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制，此方面的研究需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)改善高血壓大鼠血壓癥狀的同時(shí)使小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)適應(yīng)性變化；運(yùn)動(dòng)有助于維持小動(dòng)脈中VSMC收縮表型。miR-143/145可能參與了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的VSMC表型適應(yīng)性變化。miR-145對Akt呈負(fù)向調(diào)節(jié)，可能參與了VSMC表型轉(zhuǎn)換過程中Akt信號通路的反饋調(diào)節(jié)。運(yùn)動(dòng)后Akt的激活并不是miR-145過表達(dá)導(dǎo)致的，提示運(yùn)動(dòng)可能通過其它途徑激活A(yù)kt信號并促進(jìn)VSMC向收縮表型轉(zhuǎn)換。