高強度間歇運動與中等強度持續(xù)運動對小鼠代謝表型及骨骼肌自噬影響的對比研究

王倩 張珊 牛燕媚 傅力

1天津醫(yī)科大學生理學與病理生理學系（天津 300070）

2天津醫(yī)科大學康復醫(yī)學系（天津 300070）

近些年來，高強度間歇運動（high intensity inter?val training，HIIT）以其耗時短、強度大、恢復快的特點，逐漸受到運動員和健身愛好者的青睞。HIIT通過快速提高運動者心率、增加身體氧耗，同時制造缺氧狀態(tài)，使機體在恢復期仍需要更多的氧氣，進而消耗額外的熱量。也正因如此，針對 HIIT的研究多集中在呼吸、循環(huán)系統(tǒng)相關臨床表現上，而對機體代謝表型及其相關信號分子通路研究較少。脂聯(lián)素（Adiponectin，Acrp30）作為脂肪細胞分泌的特異性因子，能夠經血液循環(huán)作用于機體多個組織細胞的特異性受體，增加細胞葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，從而增強細胞胰島素信號通路敏感性和細胞糖、脂代謝。Acrp30在機體內存在兩個特異性受體——脂聯(lián)素受體1/2（Adiponec?tin receptor 1，AdipoR1/2），全長Acrp30蛋白被裂解后釋放出的球狀域— gAcrp30對骨骼肌高表達的 Adi?poR1顯示出更高的親和力[1]。已有大量研究表明，gAcrp30能夠增加骨骼肌組織的葡萄糖攝取[2]。HIIT顯著的減脂效應使得人們開始揣測其在降低脂肪組織體積的情況下，對諸如 Acrp30等有益脂肪因子的影響。大多數研究顯示，HIIT顯著減脂的同時，能夠增加Acrp30的表達。但也有部分研究結果與其相反[3,4]，其差異可能與HIIT運動方案、受試者基礎健康狀況以及所檢測Acrp30的形式有關。細胞自噬因其廣泛參與機體的各種病理生理過程，成為目前生物醫(yī)學領域研究熱點。自噬是為機體提供燃料的生理途徑，在 HIIT造成的細胞能量迅速消耗狀態(tài)下，骨骼肌細胞自噬應對能源物質急速耗竭的反應如何目前尚不清楚。因此，本實驗對比中等強度持續(xù)運動（moderate intensity continuous training，MICT）與HIIT兩種不同運動形式對小鼠體成分、血清gAcrp30水平等代謝表型以及骨骼肌細胞自噬相關蛋白表達的作用，從而為HIIT防治胰島素抵抗等代謝性疾病提供實驗證據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物分組

4周齡C57BL/6雄性小鼠36只（體重15.00±0.32 g），飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為安靜對照組（Control組）、中等強度持續(xù)運動組（Moderate Intensity Continuous Training，MICT組）和高強度間歇運動組（High Intensity Interval Training，HIIT組），每組各12只。均給予12小時光照。均采用正常飲食喂養(yǎng)，飼料為1022配合維持飼料（常規(guī)營養(yǎng)成分：水分≤8.0%，粗蛋白≥18.0%，粗纖維≤5.0% ，粗脂肪≥4.0%）。

1.2 運動方案

適應性喂養(yǎng)1周后，運動干預 6周。MICT組為12 m/min（75%VO2max）強度的持續(xù)跑臺訓練，60分/次，1 次/天，5 次/周,共持續(xù) 6 周；HIIT 組為 20 m/min（85%VO2max）持續(xù)1分鐘與8 m/min（50%VO2max）持續(xù)1分鐘的運動交替進行12個循環(huán)，1次/天，5次/周，共持續(xù)6周（參照 Fernando等制定的跑速與最大攝氧量對應表）[5]。

1.3 檢測方法

1.3.1 體成分檢測

各組小鼠在6周運動結束24小時后，應用Impedi-VET進行體成分分析，實驗完成后，ImpediVET軟件生成綜合報告，并進行數據分析，輸出體重、體質指數（BMI）、總體液量和脂肪含量等數據。最后將所有小鼠采用頸椎脫臼法處死，采用小動物手術器械分離完整股四頭肌，迅速將其放入液氮（－196℃）中速凍，隨后轉入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清ggAAccrrpp3300檢測

各組動物運動結束48小時后，留取血樣（眼內眥采血法），靜置30分鐘后，4oC 離心（3000 rpm，15分鐘），提取上清液，應用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對血清gAcrp30水平進行檢測。

1.3.3檸檬酸合酶（Citrate synthhaassee，CCSS）活性檢測

檸檬酸合酶（Citrate synthase，CS）能夠催化來自糖酵解或者其他異化反應的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成檸檬酸，控制三羧酸循環(huán)的入口，是肝臟和骨骼肌等組織細胞三羧酸循環(huán)過程的限速酶。本實驗檢測運動干預后小鼠股四頭肌組織CS活性，在組織層面確認運動干預的效果。檢測步驟依據文獻所述[6]。

1.3.4 Western BBlloott檢測ppAAMMPPKK α--TThhrr117722、LLCC 33Ⅱ//Ⅰ、pp 6622、Beecclliinn 11蛋白表達

NP-40法提取股四頭肌組織蛋白（裂解液：1%NP-40+EDTA 15 mM（pH 8.0）+NaCl 150 mM+Tris 50 mM），充分混勻；離心后取上清。制備5%積層膠，根據目的蛋白分子量，制備不同濃度分離膠，將等量總蛋白加入樣品孔，隨后加入電泳緩沖液，于凝膠電泳緩沖液（pH 7.6）內電泳2小時（電壓：60 V轉110 V）。采用濕法電轉印法，轉膜2小時（電流：300 mA）。根據預染蛋白Marker轉移情況，判斷蛋白轉移情況。轉膜結束后，5% 脫脂牛奶封閉1小時。在封閉過的膜上，分別孵育pAMPKα-Thr172、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1和 β-tubulin一抗（抗體稀釋比例見表1），TBST洗膜（10分鐘 × 3次），二抗（1︰20000）室溫孵育1小時，TBST洗膜（10分鐘×3次），ECL反應液做發(fā)光底物，用X光膠片暗室曝光，掃描，應用 Image J軟件定量分析結果。

1.4 統(tǒng)計學處理

SPSS（SPSS13.0 for Windows）統(tǒng)計軟件處理數據，計算均值和標準差（±s）。單因素方差分析（Oneway ANOVA）進行組間分析。將P＜0.05定為組間顯著差異性標準。

表1 抗體稀釋比例

2 結果

2.1 體成分分析結果

6周運動結束后，MICT組小鼠體重（Body Weight）顯著低于Control組（P＜0.05），而HIIT組小鼠體重更加顯著地低于Control組（P＜0.01），同時也顯著低于MICT組（P＜0.05），結果提示，MICT和HIIT均能有效控制健康雄性小鼠個體的體重，但就本實驗結果來看，HIIT在控制體重方面的效應要優(yōu)于MICT。6周運動結束后，各組的總體液量（Total body water）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HIIT組的體質指數（BMI）顯著低于Control組（P＜0.01），而MICT組與Control無顯著差異；此外，MICT組的體脂含量（Fat Mass）顯著低于Control組（P＜0.05），而HIIT組的脂肪含量與Control相比更具顯著性（P＜0.01），同時HIIT組的脂肪含量也顯著低于 MICT組（P＜0.05），提示6周HIIT能有效控制運動組小鼠BMI值和體脂含量（見表2），而6周的MICT未能達到相同效果。

表2 體成分分析結果

2.2 不同運動形式對小鼠股四頭肌檸檬酸合酶活性的影響

各組小鼠股四頭肌CS活性檢測結果如圖1所示，6周MICT后小鼠股四頭肌組織CS活性呈現出高于對照組的趨勢，但不具有顯著性效果（P＞0.05）。而6周HIIT后小鼠股四頭肌組織CS活性顯著高于對照組（P＜0.01），表明 HIIT干預增加骨骼肌細胞代謝、增加機體能量消耗，可能是HIIT顯著降低小鼠體重、BMI和體脂含量的原因之一。

2.3 不同運動形式對小鼠血清球形脂聯(lián)素水平的影響

如圖2所示，HIIT組的血清gAcrp30水平顯著高于對照組（P＜0.01），而MICT組僅表現出輕微上升，但不具顯著性（P＞0.05）；提示與傳統(tǒng)MICT運動方式相比，6周 HIIT能夠顯著增加小鼠血清gAcrp30水平。

圖1 各組小鼠股四頭肌檸檬酸合酶活性比較

圖2 各組小鼠血清球形脂聯(lián)素濃度比較

2.4 不同運動形式對小鼠骨骼肌組織自噬相關蛋白的影響

對小鼠股四頭肌組織中自噬相關蛋白進行定量分析的結果如圖3所示，MICT組和HIIT組小鼠骨骼肌組織AMPK-Thr172位點的磷酸化水平均顯著高于對照組（P＜0.05），只有 HIIT 組中自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表達顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），p62表達顯著低于對照組（P＜0.05），而MICT組中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62的表達與對照組相比則沒有顯著變化（P＞0.05），提示HIIT能夠顯著增加小鼠骨骼肌組織AMPK-Thr172位點的磷酸化，增加骨骼肌細胞自噬。

3 討論

運動作為一種減脂增肌的有效手段，已得到廣泛應用。HIIT作為一種新興的運動模式，由于其具有耗時短、能夠迅速達到最大運動效率的優(yōu)勢，因此近些年來得到了運動員、教練員和研究人員的廣泛關注[2,7]。雖然目前對HIIT尚無全面的定義，但通常是指短時間的間歇配合最大或接近于VO2max強度的運動訓練[8]。HIIT作為一種省時高效的運動方式，已有研究證明其在改善心血管系統(tǒng)功能方面的顯著作用[2]，但對其在機體內分泌代謝方面的影響，及其可能機制仍有待解決。

圖3 各組小鼠骨骼肌組織自噬相關蛋白表達的對比

基于HIIT在運動訓練中呈現的顯著效果，針對HI?IT與傳統(tǒng)MICT優(yōu)越性方面的對比研究也在不斷拓展，已有大量研究致力于HIIT相比MICT在提高心肺耐力、改善心肺功能方面的突出效應[9,10]，近些年來隨著HIIT在全民健身運動中的推廣，其在增強心肺代謝功能方面的作用也日漸凸顯。有研究表明，每周3次、持續(xù)3周的高強度間歇運動，雖然對腰臀比的影響不明顯，但顯著降低了青少年個體的體重、BMI和身體脂肪厚度[11]。前期已有研究表明，HIIT的運動方式結合地中海飲食能夠顯著改善肥胖患者的體成分和胰島素敏感性[2]，強調在HIIT過程中，飲食對于實驗結果影響的重要性。本實驗選用C57BL/6小鼠為研究對象，排除了基礎健康水平差異對實驗結果的影響。Shing等人也發(fā)現，經4周 HIIT干預后，受試個體除VO2max和最大輸出功率顯著增加外，受試者體脂含量也顯著下降，而這些改變并未在中等強度持續(xù)運動組中出現[12]，與本實驗研究結果一致。

大多數的Acrp30以全長形式存在于血漿中，而球狀片段可能由活化的單核細胞和/或嗜中性粒細胞分泌的白細胞彈性蛋白酶通過切割產生[13]。有研究顯示，在進行了6個月耐力運動的正常成人中，盡管胰島素活性顯著提高，但其血漿空腹Acrp30水平并未出現明顯上升[14]，在本實驗中，6周的MICT干預也未能增加血清gAcrp30的水平，6周的HIIT則顯著增加了小鼠血清gAcrp30水平，降低了體脂含量。近些年來針對運動影響Acrp30的研究眾多，但結果卻大相徑庭，推測運動影響Acrp30水平可能受很多因素的影響，如機體對運動的適應度、體重變化、基礎健康狀態(tài)、年齡、性別、訓練強度、訓練持續(xù)時間和訓練類型等。

已知在營養(yǎng)缺乏、免疫應答或環(huán)境刺激等條件下，機體的自噬水平會增強。為了探究HIIT造成的細胞能量迅速消耗的狀態(tài)下，骨骼肌細胞自噬應對“饑餓”的響應如何，我們對小鼠股四頭肌組織自噬相關蛋白進行定量分析，結果顯示，與安靜對照組相比，6周的MICT和HIIT均顯著增加了小鼠骨骼肌組織 AMPKThr172位點的磷酸化水平，但只有6周HIIT增加骨骼肌組織自噬相關蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表達，而p62表達下降，提示6周HIIT增加了骨骼肌細胞自噬活性。

4 總結

本研究通過對比高強度間歇運動和中等強度持續(xù)運動對C57BL/6小鼠代謝表型的影響，證實了HIIT在控制體重、降低BMI以及改善體成分等方面的良好效應。同時，我們還發(fā)現與MICT組小鼠相比，HIIT在增加血清gAcrp30水平方面效果更為顯著，骨骼肌細胞自噬活性增加更為顯著。后續(xù)研究應側重HIIT應用過程中相關要素的機制探討，為今后HIIT在保障安全前提下的廣泛應用以最大限度提高運動效果提供科學依據。