基于主成分分析和灰色關(guān)聯(lián)分析方法評(píng)價(jià)雷公藤配伍金錢(qián)草相殺減毒作用的化學(xué)基礎(chǔ)

王君明，李金花，蔡泓，李金洋，張?jiān)略?，陳榮幸，李軍，崔瑛，2

雷公藤（LGT）防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、癌癥、腎病等療效卓著但毒性甚大［1］，嚴(yán)重限制了其卓越療效的發(fā)揮及應(yīng)用。中藥學(xué)理論認(rèn)為，金錢(qián)草（JQC）殺LGT毒，LGT與JQC配伍屬于中藥相殺配伍范疇［2］。然而，迄今為止，LGT 與JQC配伍相殺減毒的科學(xué)依據(jù)依然未知，一定程度上限制了二者配伍的廣泛、合理應(yīng)用。近年來(lái)，主成分分析（PCA）［3-6］

和灰色關(guān)聯(lián)分析（GCA）［7-10］方法已廣泛應(yīng)用于中藥研究。本課題組前期研究已證實(shí)LGT與JQC配伍具有抗癌增效作用［11-12］，但二者配伍的相殺減毒作用至今缺乏科學(xué)依據(jù)。本研究基于PCA和GCA分析方法初步評(píng)價(jià)LGT與JQC配伍相殺減毒作用，以期為二者配伍的安全性提供臨床前初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究時(shí)間 2015年10月。

1.2藥物 LGT：采自福建省泰寧縣，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤的干燥根。JQC：購(gòu)自河南本草國(guó)藥館連鎖有限公司（產(chǎn)地四川，批號(hào)150801），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定為報(bào)春花科植物過(guò)路黃的干燥全草。雷公藤甲素（TP）：成都曼斯特生物科技有限公司〔批號(hào)MUST-15081405，純度99.78%，高效液相色譜法（HPLC）〕。雷公藤紅素（CEL）：成都曼斯特生物科技有限公司〔批號(hào)MUST-15082610，純度99.79%，HPLC〕。乙酸乙酯（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司（批號(hào)20150314）。甲醇（色譜純）：USA，批號(hào)150905104。乙腈（色譜純）：USA，批號(hào)013880。

1.3主要儀器 高效液相色譜儀：Waters e2695，美國(guó)Waters公司。紫外檢測(cè)器：Waters 2489，美國(guó)Waters公司。色譜柱：Reprosil-Pur Basic C18 （5 μm，250.0 mm×4.6 mm），德國(guó)邁克（Dr.Maisch）公司。十萬(wàn)分之一分析天平：AB145S，上海?？惦娮觾x器廠。

1.4方法

1.4.1供試品溶液的制備 分別取適量LGT及LGT/JQC不同質(zhì)量配比組合物（LGT/JQC=4/1、2/1、1/1、1/2、1/4），加10倍量乙酸乙酯（1∶10），浸泡1 h后，回流提取3次，每次2 h，以4 000 r/min離心10 min（離心半徑9 cm），合并離心上清液，回收乙酸乙酯，減壓干燥，分別得乙酸乙酯提取 物（EAE）、4/1 EAE、2/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE、1/4 EAE的干浸膏。分別精密稱取各干浸膏適量，加甲醇配置一定濃度（約20.9 mg/ml）的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得配伍前后各提取物干浸膏的供試品進(jìn)樣液。

1.4.2TP和CEL含量測(cè)定、化學(xué)差異、差異特征峰指認(rèn)及化學(xué)得分獲得 測(cè)定TP的流動(dòng)相由乙腈和水組成，乙腈/水=35/65，流速1 ml/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，進(jìn)樣體積20 μl。測(cè)定CEL的流動(dòng)相由甲醇（A）和5%醋酸（B）組成，0～20 min：A/B=90/10，20～30 min：A/B=90/10～100/0梯度洗脫，流速0.8 ml/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)422 nm，進(jìn)樣體積20 μl。

用甲醇分別配置TP和CEL對(duì)照品溶液，濃度分別為65、240 mg/ml。分別用甲醇等比倍比稀釋?zhuān)ū侗?/2）5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，按照以上液相測(cè)定條件分別進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，TP的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2 361 360X-652 716，r=0.999 5；CEL標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2 000 000X-57 818，r=0.999 7。表明TP和CEL的線性關(guān)系均良好。

分別精密稱取各提取物適量，用甲醇配置一定濃度的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得各提取物的供試品溶液。按以上測(cè)定條件，連續(xù)進(jìn)樣5次對(duì)照品溶液，根據(jù)峰面積積分值計(jì)算，TP的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=0.59%，CEL的RSD=0.17%，均＜3%，表明儀器的精密度良好；取EAE供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，根據(jù)峰面積積分值計(jì)算，TP的RSD=1.27%，CEL的RSD=1.73%，均＜3%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；取同一批次的LGT，按提取物制備到供試品溶液配置，平行操作制備6份供試品溶液，按以上色譜條件進(jìn)行分別測(cè)定，TP的RSD為1.91%，CEL的RSD=1.28%，均＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

在確定線性、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的基礎(chǔ)上，各提取物平行制備3份供試品溶液，按以上測(cè)定條件分別注入HPLC，記錄峰面積積分值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TP和CEL含量；并根據(jù)配伍前后HPLC圖譜比對(duì)，尋找配伍前后的化學(xué)差異特征峰，并記錄差異特征峰峰面積積分值。

將配伍前后各組的TP和CEL含量以及未知差異特征峰峰面積積分值，經(jīng)過(guò)PCA方法計(jì)算化學(xué)得分Z值，該得分可從較多成分的角度總體反映配伍前后的化學(xué)差異，較常用一兩個(gè)指標(biāo)性成分的評(píng)價(jià)模式具有信息量大/更全面等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)提取的信息量即公因子方差對(duì)TP和CEL含量進(jìn)行加權(quán)，可得二者的加權(quán)含量（TP-CEL）。經(jīng)PCA分析，得各提取物（n=3）的F1和F2，按照F1和F2解釋的方差換算，得各提取物的化學(xué)得分Z值?；瘜W(xué)得分Z值=F1×47.980%+F2×46.881%。

1.4.3差異特征峰與化學(xué)得分的灰色關(guān)聯(lián)分析 采用GCA方法，將TP、CEL及其他化學(xué)差異特征峰均與化學(xué)得分Z值進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，并按照灰色關(guān)聯(lián)度大小進(jìn)行排序，比較各化學(xué)差異特征峰對(duì)化學(xué)得分的影響程度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x± s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用DPS 16.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行GCA分析。

2　結(jié)果

2.1化學(xué)差異特征峰識(shí)別 LGT與JQC配伍前后各提取物在TP測(cè)定條件下，共產(chǎn)生7個(gè)差異特征峰，分別為T(mén)P、1～6號(hào)峰（見(jiàn)圖1）。在CEL測(cè)定條件下，產(chǎn)生CEL、7～10號(hào)共計(jì)5個(gè)差異特征峰，其中，7～10號(hào)峰是LGT單用提取物EAE中所未檢測(cè)到的，經(jīng)配伍JQC后才出現(xiàn)的（見(jiàn)圖2）。綜合結(jié)果可知，TP和CEL測(cè)定條件下差異特征峰共有12個(gè)，分別為 TP、CEL、1～10號(hào)峰。

2.2化學(xué)差異特征峰主成分分析結(jié)果

2.2.1差異特征峰的公因子方差 對(duì)12個(gè)化學(xué)差異特征峰進(jìn)行PCA分析，經(jīng)適應(yīng)性檢驗(yàn)，Kaiser-Meyer-Olkin （KMO）值=0.763＞0.5，且Bartlett's球形檢驗(yàn)P=0.000＜0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)適合PCA分析。經(jīng)PCA分析，各差異特征峰的公因子方差為0.896～0.986，平均值0.949，提示12個(gè)差異特征峰被提取的信息平均在94.9%，僅有大約5.1%的信息損失（見(jiàn)表1）。

圖1　雷公藤甲素測(cè)定條件下HPLC指紋圖譜及配伍前后化學(xué)差異特征峰Figure 1 HPLC fingerprints and characteristic differences in chemistry before and after compatibility under TP-determined conditions

圖2　雷公藤紅素測(cè)定條件下HPLC指紋圖譜及配伍前后化學(xué)差異特征峰Figure 2 HPLC fingerprints and characteristic differences in chemistry before and after compatibility under CEL-determined conditions

表1　差異特征峰的公因子方差Table 1 Common factor variance of differential characteristic peaks

2.2.2主成分特征根及解釋的方差 進(jìn)一步PCA分析，12個(gè)差異特征峰被降維，產(chǎn)生2個(gè)主成分F1和F2，二者解釋的總方差為94.861%，提示F1和F2累計(jì)解釋了配伍前后94.861%的化學(xué)差異信息。2個(gè)主成分的特征根及解釋的方差見(jiàn)表2。

表2　主成分特征根及解釋的方差Table 2 Principal component eigenvalue and variance of interpretation

2.2.3旋轉(zhuǎn)后成分矩陣 最大方差法旋轉(zhuǎn)分析，可知F1由TP、1～6號(hào)成分組成，F(xiàn)2由CEL、7～10號(hào)成分組成。旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣絕對(duì)值均＞0.700（見(jiàn)表3）。

表3　旋轉(zhuǎn)后成分矩陣Table 3 The rotated component matrix

2.3TP和CEL加權(quán)含量及化學(xué)得分Z值比較 將各提取物加權(quán)含量進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，得P=0.002＜0.05，提示方差不齊，采用方差不齊常采用的Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析。4/1 EAE、2/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE、1/4 EAE 加權(quán)含量（TP-CEL）均低于EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2/1 EAE TP-CEL低于4/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1/4 EAE TP-CEL低于4/1 EAE、2/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

將各提取物化學(xué)得分Z值進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，得P=0.094＞0.05，提示方差齊，采用LSD-t進(jìn)行兩兩比較分析。4/1 EAE、2/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE、1/4 EAE化學(xué)得分Z值低于EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2/1 EAE化學(xué)得分Z值低于4/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1/4 EAE組化學(xué)得分Z值低于4/1 EAE、2/1 EAE、1/1 EAE、1/2 EAE，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

表4　配伍前后TP和CEL加權(quán)含量及化學(xué)得分Z值的比較（n=3）Table 4 Comparison of TP and CEL weighted content and chemical score Z value before and after compatibility

2.4差異特征峰與化學(xué)得分Z值的灰色關(guān)聯(lián)分析 將差異特征峰與化學(xué)得分Z值進(jìn)行GCA分析，得各差異特征峰的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)，并按灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)進(jìn)行排序。排在第1的是3號(hào)特征峰，TP和CEL分別排在12個(gè)特征峰中的第8和第9（見(jiàn)表5）。

表5　差異特征峰與化學(xué)得分Z值的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及排序Table 5 Sorting of the gray correlation coefficients between differential characteristic peaks and chemistry scores

3　討論

LGT與JQC配伍屬于中藥相殺配伍的范疇，然而，其相殺減毒的化學(xué)基礎(chǔ)依然未知。本研究通過(guò)采用PCA和GCA分析方法闡釋了LGT配伍JQC相殺減毒的化學(xué)基礎(chǔ)，并據(jù)此初步評(píng)價(jià)了二者配伍的相殺減毒作用。結(jié)果表明，LGT配伍JQC后產(chǎn)生的12個(gè)差異化學(xué)成分（特征峰）為二者配伍相殺減毒作用重要的化學(xué)基礎(chǔ)；將12個(gè)差異化學(xué)成分經(jīng)PCA降維，獲得2個(gè)主成分，進(jìn)而獲得化學(xué)總得分Z值，并將各提取物化學(xué)總得分Z值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以闡釋二者配伍的相殺減毒作用，結(jié)果顯示，二者在質(zhì)量配比為4/1～1/4時(shí)，化學(xué)總得分均顯著降低，其中尤以1/4時(shí)為最低，且1/4配比下與其他各配比比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示從化學(xué)角度來(lái)說(shuō)，LGT/JQC在質(zhì)量配比4/1～1/4均有相殺減毒作用，而且最佳配比為1/4。

PCA分析中各成分解釋的公因子方差，反應(yīng)該成分在PCA分析中提取的有效信息量和損失的信息量，一般要求公因子方差在0.6以上，也就是提取的信息需在60%以上，相應(yīng)損失的信息量需在40%以下。在本研究中，所有特征峰的公因子方差均在0.896及以上，提示提取信息均在89.6%及以上，損失信息均僅在10.4%及以下，很好地滿足了PCA分析的基本要求。經(jīng)PCA分析后，降維生成的主成分解釋的總方差須在85%以上，本研究降維生成的2類(lèi)主成分解釋的總方差為94.861%，說(shuō)明本研究PCA分析結(jié)果良好。

此外，考慮到TP和CEL均為L(zhǎng)GT主要有效成分之一，本研究應(yīng)用TP和CEL解釋的公因子方差數(shù)值，對(duì)二者含量進(jìn)行加權(quán)，形成加權(quán)含量TP-CEL，從TP-CEL角度闡釋LGT配伍JQC的相殺減毒作用，結(jié)果與通過(guò)化學(xué)總得分Z值的分析基本一致，只是僅從TP-CEL角度分析，配伍后成分降幅低于通過(guò)化學(xué)總得分Z值分析后的降幅，這可能與通過(guò)12個(gè)多成分PCA分析比僅從TP-CEL兩個(gè)成分的加權(quán)分析反映的信息更全面、得到的結(jié)果更準(zhǔn)確有關(guān)。

進(jìn)一步通過(guò)GCA分析方法對(duì)12個(gè)差異化學(xué)成分與其化學(xué)總得分進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，由灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)大小判斷差異化學(xué)成分對(duì)化學(xué)總得分的貢獻(xiàn)程度，并據(jù)此評(píng)價(jià)12個(gè)差異化學(xué)成分對(duì)LGT配伍JQC相殺減毒的重要程度，從化學(xué)方面初步證實(shí)3號(hào)特征峰為二者配伍相殺減毒最為關(guān)鍵的成分，其次為6號(hào)特征峰，而TP和CEL僅排在第8和第9，提示緊靠目前主要以TP和CEL為主要化學(xué)成分來(lái)評(píng)價(jià)LGT質(zhì)量不全面更不可取，而從一定程度上，以本研究發(fā)現(xiàn)的12個(gè)差異化學(xué)成分來(lái)綜合評(píng)價(jià)則更全面更可取。然而，本研究未能對(duì)未知差異特征峰（尤其是貢獻(xiàn)最大的3號(hào)和6號(hào)未知特征峰）進(jìn)行定性辨識(shí)，是本研究的不足之處。

作者貢獻(xiàn)：李金花、蔡泓、李金洋、陳榮幸參與了實(shí)驗(yàn)研究；張?jiān)略聟⑴c了文獻(xiàn)資料的收集；李軍和崔瑛參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；李金花、李金洋參與文章初稿撰寫(xiě)；王君明負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究經(jīng)費(fèi)支持、文章質(zhì)量控制及審核，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。