雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)提高順鉑對(duì)Hep3B干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性

上官醉飛 毛其芬?

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織細(xì)胞群體中一群有干細(xì)胞特征的特殊腫瘤細(xì)胞，表達(dá)CD133、Bmi-1和Oct4等干細(xì)胞表面標(biāo)志。文獻(xiàn)報(bào)道相比常規(guī)腫瘤細(xì)胞，這群腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療的敏感性較低，因此這群有較強(qiáng)自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞是造成化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素［1-2］。順鉑是治療肝癌的有效藥物，然而肝癌干細(xì)胞對(duì)順鉑的高度抵抗性常造成化療的失?。?］，本研究探討雷公藤紅素是否能提高順鉑對(duì)肝癌干細(xì)胞的殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：順鉑、雷公藤紅素、噻唑藍(lán)［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5- diphenyltetrazolium bromide，MTT］、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco。蛋白提取液、PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl和β-actin.兔抗人抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。CD133-FITC熒光抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司。PTEN siRNA（正向 ： GCACAAGAGGCCCUAGAUUTT，反向： AAUCUAGGGCCUCUUGUGCTT）購(gòu)于上海吉瑪生物。Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz。（2）細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞系Hep3B購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。Hep3B腫瘤干細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，CD133陽(yáng)性的Hep3B細(xì)胞即為Hep3B腫瘤干細(xì)胞［4］。分選后的Hep3B腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。Hep3B腫瘤干細(xì)胞傳代1次/2～3d，傳代時(shí)，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1：3稀釋后傳代。

1.2 方法 （1）PTEN siRNA轉(zhuǎn)染：使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說(shuō)明書(shū)步驟將50 pmol/ml PTEN siRNA轉(zhuǎn)染入Hep3B腫瘤干細(xì)胞中，培養(yǎng)24h。（2）MTT法檢測(cè)雷公藤紅素和順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 ：將Hep3B腫瘤干細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組、順鉑組、雷公藤紅素組、順鉑+雷公藤紅素組及順鉑+雷公藤紅素+PTEN siRNA組，分組培養(yǎng)方法見(jiàn)表1。藥物處理時(shí)間為48h。處理完畢后在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20ml MTT（5mg/ml）培養(yǎng)4h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100μl二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/ OD對(duì)照組×100%。（3）免疫共沉淀：將Hep3B腫瘤干細(xì)胞按上述進(jìn)行分組處理，用細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行裂解，12000r/min離心10min，收取上清液。上清液平均分成兩份，一份用作對(duì)照檢測(cè)β-actin的表達(dá)水平，另一份加入Bad抗體孵育過(guò)夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后1200r/min離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后小心吸去上清液，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min后備用。用Bad蛋白免疫共沉淀與Bad結(jié)合的Bcl-2和Bcl-xl蛋白。（4）Western blot實(shí)驗(yàn)：將Hep3B腫瘤干細(xì)胞按上述進(jìn)行分組處理，之后用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。將總蛋白質(zhì)或從（1）（2）（3）所述步驟中得到的免疫共沉淀蛋白用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl或β-actin兔抗人抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。（5）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：將Hep3B腫瘤干細(xì)胞按上述進(jìn)行分組處理，之后按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

表1 Hep3B腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組方法

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較用Student's t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素提高順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性 順鉑和雷公藤紅素單獨(dú)處理對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性較弱，兩者聯(lián)合后能顯著誘導(dǎo)Hep3B腫瘤干細(xì)胞發(fā)生死亡。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雷公藤紅素處理能顯著上調(diào)Hep3B腫瘤干細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平，而順鉑處理對(duì)PTEN的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。當(dāng)轉(zhuǎn)染PTEN siRNA以阻斷雷公藤紅素對(duì)PTEN的誘導(dǎo)作用后，雷公藤紅素不能提高順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性，表明雷公紅素可能通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)增強(qiáng)順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性。見(jiàn)表2、圖1。

表2 雷公紅素增強(qiáng)順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性（x±s）

圖1 雷公藤紅素上調(diào)Hep3B腫瘤干細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)水平

2.2 雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)抑制PI3K和AKT的磷酸化 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hep3B腫瘤干細(xì)胞的PI3K和AKT磷酸化水平較高，順鉑單獨(dú)處理對(duì)PI3K和AKT和的磷酸化水平影響不大，Hep3B腫瘤干細(xì)胞用雷公藤紅素處理后，PI3K和AKT的磷酸化水平顯著下降。另外，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA能顯著減弱雷公藤紅素對(duì)PI3K和AKT磷酸化的抑制作用，結(jié)果表明雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)抑制Hep3B腫瘤干細(xì)胞中PI3K/AKT通路的磷酸化。見(jiàn)圖2。

圖2 雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)抑制PI3K和AKT的磷酸化

2.3 雷公藤紅素通過(guò)促進(jìn)Bad與Bcl-2、Bcl-xl的結(jié)合增強(qiáng)順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雷公藤紅素能顯著增強(qiáng)Bad蛋白與Bcl-2和Bcl-xl的相互作用（見(jiàn)圖3），從而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的活性。Western blot和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雷公藤紅素能顯著促進(jìn)順鉑依賴的caspase-3的活化（見(jiàn)圖4）和凋亡的誘導(dǎo)（見(jiàn)圖5）。另外，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA后順鉑聯(lián)合雷公藤紅素誘導(dǎo)的Bad與Bcl-2、Bcl-xl的相互作用和凋亡的發(fā)生均受到顯著抑制，表明雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的凋亡途徑。

圖3 雷公藤紅素顯著增強(qiáng)Bad蛋白與Bcl-2和Bcl-xl的相互作用

圖4 雷公藤紅素增強(qiáng)順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞caspase-3的活化

圖5 雷公藤紅素增強(qiáng)順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性

3 討論

肝癌干細(xì)胞的存在是造成肝癌細(xì)胞耐藥和化療后復(fù)發(fā)的重要因素，嚴(yán)重影響肝癌患者的預(yù)后［5］。順鉑是治療肝癌的有效藥物，其能阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的修復(fù)從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序［6］。然而肝癌干細(xì)胞的耐藥性顯著降低順鉑的療效，因此靶向于肝癌干細(xì)胞的輔助治療是提高順鉑抗腫瘤活性的有效方法。雷公藤紅素是一種三萜類化合物，來(lái)源于中藥雷公藤的根皮，具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞自噬或凋亡性死亡［7-8］，然而雷公藤紅素在腫瘤干細(xì)胞中的作用，至今仍較少報(bào)道。在本資料中，雷公藤紅素能顯著提高順鉑對(duì)Hep3B腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性，表明雷公藤紅素能減弱肝癌干細(xì)胞對(duì)化療的抵抗性。

PI3K/AKT途徑的過(guò)度活化是腫瘤增殖和存活的重要因素，PI3K和AKT的磷酸化受PTEN的調(diào)控。PTEN是一種已知的抑癌基因，能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路阻斷腫瘤的發(fā)生。研究表明PTEN在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，PTEN基因的突變或缺失是腫瘤發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9-10］。本資料中，雷公藤紅素能上調(diào)肝癌干細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，且雷公藤紅素通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)增強(qiáng)提高Hep3B腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

Bad是Bcl-2促凋亡蛋白家族成員，是AKT激酶的底物。PI3K/AKT途徑的過(guò)度活化能誘導(dǎo)Bad與Bcl-2或Bcl-xl發(fā)生解離，從而使Bcl-2和Bcl-xl游離出來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用［11-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雷公藤紅素能上調(diào)肝癌干細(xì)胞中的PTEN表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的PI3K/AKT通路，使Bcl-2和Bcl-xl保持與Bad的結(jié)合從而抑制Bcl-2和Bcl-xl的抗凋亡活性，提高順鉑對(duì)肝癌腫瘤干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。

綜上所述，雷公藤紅素能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌干細(xì)胞的殺傷活性。作者認(rèn)為雷公藤紅素上調(diào)PTEN的表達(dá)并抑制Bcl-2、Bcl-xl與Bad的解離，從而促進(jìn)順鉑對(duì)肝癌干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。