LC—MS/MS法測定人血漿中多粘菌素E濃度分析方法的建立

張莉婷　周春娣　李建祥

【摘要】目的：建立人血漿中多粘菌素E濃度測定的LC-MS/MS方法，方法：樣品處理：蛋白沉淀；采用Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）色譜柱；流動相05%甲酸水溶液（A）-05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫；流速為065 -24mL/min；內(nèi)標(biāo)物：多粘菌素B1；質(zhì)譜檢測，正離子模式。結(jié)果：多粘菌素E1的線性范圍是200～2000 ng/mL（r2=09984），定量下限為200 ng/mL。批內(nèi)精密度≤42%，批間精密度≤37%；提取回收率在1003%-1135%之間，總體變異系數(shù)（%CV）為62%。本方法定量下限低，血漿前處理方法操作簡便，節(jié)約成本。結(jié)論：建立的方法準(zhǔn)確精密、穩(wěn)定可靠，可用于人血漿中多粘菌素E1濃度的檢測。

【關(guān)鍵詞】 多粘菌素E；LC-MS/MS；蛋白沉淀

【中圖分類號】

R764.04【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

B【文章編號】1005-0019（2018）06-220-01

多粘菌素是從多粘桿菌培養(yǎng)液中分離出的一種含多種組分的堿性多肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)是由環(huán)狀多肽和脂肪酸結(jié)合而成，可分為多粘菌素A、B、C、D、E、K、M和P共8種。其中多粘菌素E在該類抗生素中毒副作用小，在臨床上應(yīng)用較多[1]。多粘菌素E是一種由至少30種不同的成分組成的復(fù)雜混合物[2]，其主要成分是多粘菌素E1（colistin A）和少量多粘菌素E2（colistin B）。多粘菌素E對革蘭氏陰性菌引起的感染有較強作用，抗菌譜主要為大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、嗜血桿菌和銅綠假單胞菌等病原菌，并且這些細(xì)菌對氨基糖苷類，β內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類等常用抗菌藥物的耐藥性相當(dāng)普遍，許多菌更是多重耐藥[3]，但是多粘菌素E不易產(chǎn)生耐藥性。上世紀(jì)70年代多粘菌素因其腎毒性和神經(jīng)毒性一度被棄用，然而多重耐藥革蘭氏陰性菌的出現(xiàn)促使多粘菌素重新成為人們治療革蘭氏陰性菌的重要選擇，再度被應(yīng)用于臨床[4]，EVANS等人為：多粘菌素E是治療多重耐藥性革蘭氏陰性菌感染重要而又有效的手段[5]。目前對多粘菌素E的分析方法主要有HPLC法，MECC法和LC-MS/MS法，由于多粘菌素E的紫外吸收低，因而應(yīng)用傳統(tǒng)HPLC法（紫外檢測器）分析對檢測器靈敏度要求較高。LC-MS/MS法廣泛應(yīng)用于多粘菌素E的藥代動力學(xué)、臨床檢測等領(lǐng)域，在藥動學(xué)研究中使用該方法需要選擇較好的生物樣品前處理方法，本研究采用蛋白沉淀樣品的前處理方式，建立了血漿中多粘菌素E的LC-MS/MS檢測方法，簡化了血漿預(yù)處理過程，對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，為人血漿樣品中多粘菌素E濃度的測定提供了更簡便易操作和節(jié)約成本的方法。

1儀器與材料

11儀器質(zhì)譜儀API5000（美國Applied Biosystem公司）；島津高效液相色譜（DGU-20A5在線真空脫氣機；LC-20AD液相泵；SIL-20ACXR自動進(jìn)樣器；CBM-20A控制器構(gòu)成，日本島津公司）；微量分析天平（XP6，梅特勒-托利多）；高速臺式冷凍離心機（5810R，eppendorf）；渦旋震蕩儀（M37610-33CN，Thermo）；超純水系統(tǒng)（Millipore）

12材料多粘菌素E標(biāo)準(zhǔn)品（批號1304FP0708 ，Sigma）；多粘菌素B1標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，批號：0248069-6，Cayman）；甲酸（色譜純，sigma）；乙腈（色譜純，sigma）；甲醇（色譜純，sigma）；去離子水（Millipore）

2方法

21色譜條件色譜柱Agilent Polaris C18（50 * 3 mm， 3 μm）；流動相：流動相A為05%甲酸水溶液，流動相B為05%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫見下表；進(jìn)樣量10μL。

22質(zhì)譜條件ESI：正離子模式；噴霧電壓：2000V；去簇電壓：90V；碰撞能量：45V；多粘菌素E1離子對5856→1011；多粘菌素B1離子對6025→2413

23血漿樣品處理移取100 μL 血漿樣品于96深孔板中，加入100 μL稀釋液至樣品中，加入50 μL 濃度為3000ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液，加入400μL純水，渦旋使之混勻，加入400μL甲醇，800轉(zhuǎn)渦旋約1分鐘，于每分鐘3500轉(zhuǎn)，室溫下離心10分鐘，移取400μL純水于新的96孔板中，轉(zhuǎn)移200μL上清液至該96孔板中，封板后1000轉(zhuǎn)渦旋約1分鐘，于每分鐘3500轉(zhuǎn)，室溫下離心5分鐘，取上清液100μL進(jìn)樣分析。

24線性范圍使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液與空白血漿配制出濃度分別為200、400、100、200、400、800、1600和2000 ng/mL的多粘菌素E1血漿樣品，按照23項下處理，進(jìn)樣分析，以多粘菌素E1在血漿中的濃度為橫坐標(biāo)（X），以測得到的多粘菌素E1與內(nèi)標(biāo)的面積比為縱坐標(biāo)（y），使用線性最小二乘法回歸計算（權(quán)重為1/x2），得到定量的線性范圍。

25定量下限使用最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液與空白血漿配制成濃度為200ng/mL的定量下限樣品，平行配制6份，按照23項下處理，進(jìn)樣分析，得到最低定量值。

26選擇性取6個不同批次未混合的空白人血漿， 除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“23”項下處理，進(jìn)樣分析，得到空白血漿樣品色譜圖與定量下限色譜圖對比以考察選擇性。

27準(zhǔn)確度和精密度使用不同濃度的質(zhì)控工作溶液與空白血漿配制成定量下限、低、中、高4個QC濃度（200、600、300和1500ng/mL）的質(zhì)控樣品，每個濃度有6個重復(fù)的樣品，按照23項下處理，測定3個獨立分析批（與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行），得到批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度。

28基質(zhì)效應(yīng)分別取6個不同批次的空白人血漿，每個批次配制一份，除不加內(nèi)標(biāo)外，按照23項下處理，最終分別加入與處理后的低濃度（600 ng/mL）、中濃度（300 ng/mL）和高濃度（1500 ng/mL）質(zhì)控樣品濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行分析。同時配制無基質(zhì)存在的與低、中、高濃度質(zhì)控樣品濃度相當(dāng)?shù)募內(nèi)芤?，平行三份，進(jìn)樣分析。用有基質(zhì)存在的樣品中分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值與純?nèi)芤褐蟹治鑫锱c內(nèi)標(biāo)的平均峰面積比值相除來計算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子。

29提取回收率3個濃度水平（600、300和1500 ng/mL）的基質(zhì)樣品分別平行配制六份，除不加入內(nèi)標(biāo)溶液外，按照23項下處理，最終稀釋前，加入合適的內(nèi)標(biāo)溶液，確保其濃度與低濃度，中濃度和高濃度質(zhì)控樣品提取后濃度相同。同時配制回收率參比樣品，提取過程與上述相同，但是分析物和內(nèi)標(biāo)溶液均在提取后，最終稀釋前加入。用常規(guī)提取樣品中分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值與回收率參比樣品中分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值相除來計算多粘菌素E1在不同濃度水平的回收率。

210殘留評價在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量上限樣品進(jìn)樣后進(jìn)一針空白基質(zhì)樣品，通過比較空白基質(zhì)樣品中分析物和內(nèi)標(biāo)物峰面積與定量下限樣品平均峰面積來評價本方法的殘留。

211人血漿短期穩(wěn)定性分別將低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）兩個濃度的人血漿質(zhì)控樣品放置濕冰條件下（4h至24h），隨新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品一同測定，每個濃度水平平行測定6份。

212人血漿凍融穩(wěn)定性分別將低（600 ng/mL）、高（1500 ng/mL）兩個濃度的人血漿質(zhì)控樣品經(jīng)過4次凍融循環(huán)（-70℃，濕冰上融化）后隨新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品一同測定，每個濃度水平平行測定6份。

3結(jié)果

31線性范圍與定量下限多粘菌素E1在人血漿中線性范圍為200～2000 ng/mL。直線回歸方程為y=0002931x-0004906， 加權(quán)因子為（1/x2），r2為09984，最低定量下限為200 ng/mL。

32選擇性在6個不同批次的空白人血漿樣品，與定量下限樣品（如圖1所示）對比，在多粘菌素E1和內(nèi)標(biāo)物保留時間處都沒有觀察到色譜峰信號（如圖2所示）表明本方法測定人血漿中多黏菌素E1的選擇性良好，血漿基質(zhì)對測定無干擾。

33準(zhǔn)確度和精密度多粘菌素E1在人血漿中每一濃度水平多黏菌素E1質(zhì)控樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度在±81%以內(nèi)，批內(nèi)精密度≤42%，所有濃度水平的批間準(zhǔn)確度在±65%以內(nèi)，批間精密度≤37%。均符合接受標(biāo)準(zhǔn)。

34基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果如表1-1所示，多粘菌素E1在人血漿中，在所有濃度水平內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子為098～102，精密度≤39%，符合基質(zhì)效應(yīng)的考察標(biāo)準(zhǔn)。

35提取回收率在所有濃度水平使用本提取方法，結(jié)果如表1-2所示，多粘菌素E1在人血漿中的平均回收率在1003%-1135%之間，總體回收率為1062%

36殘留評價分析物的進(jìn)樣殘留峰面積在定量下限樣品峰面積的03%以內(nèi)，且內(nèi)標(biāo)的進(jìn)樣殘留峰面積在可接受分析批標(biāo)曲樣品和質(zhì)控樣品平均內(nèi)標(biāo)峰面積的00%以內(nèi)，表明以本方法測定人血漿中多黏菌素E1高濃度樣品進(jìn)樣后在系統(tǒng)中無明顯殘留，對于后續(xù)低濃度樣品的測定無影響，樣品分析時對樣品排放順序沒有要求。

37人血漿短期穩(wěn)定性將樣品放置在濕冰條件下18小時后進(jìn)樣分析，結(jié)果如表1-3所示，表明多粘菌素E1在該基質(zhì)中濕冰上放置18小時穩(wěn)定。

38人血漿凍融穩(wěn)定性樣品經(jīng)過4次凍融（-70℃，濕冰上融化）循環(huán)后，以新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定，結(jié)果如表1-3所示，表明多黏菌素E1血漿樣品可穩(wěn)定至少4次凍融循環(huán)。

4討論

在高效液相色譜法中，由于缺乏有效的發(fā)色團(tuán)，多粘菌素E的紫外吸收非常弱又沒有熒光，在樣品分析時直接采用傳統(tǒng)技術(shù)（紫外檢測器）是不能得到一個高靈敏度的定量結(jié)果的[6]，因此如果使用HPLC對多粘菌素進(jìn)行分析，就需要其他檢測器如蒸發(fā)光散射檢測器及熒光檢測器，或是對樣品進(jìn)行柱前衍生化處理，來得到一個較好的響應(yīng)值。Jian Lia[7]等采用氯甲酸（9-芴甲基）酯進(jìn)行柱前衍生化，用熒光檢測器-高效液相色譜法測定人血漿中多粘菌素E的含量，可得到穩(wěn)定的衍生物，結(jié)果選擇性好，靈敏度高，但是卻有柱前衍生化耗時且保留時間太長的缺點。近年來，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高，可獲得較低的定量限，線性范圍較寬而被廣泛應(yīng)用于生物制品中多粘菌素E的分析，但需要有較好的前處理技術(shù)（尤其生物制品）、干凈的流動相系統(tǒng)，良好的操作技術(shù)要求，用以保護(hù)質(zhì)譜，延長使用壽命[6]，Zheng Ma[8]等采用固相萃取技術(shù)對生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，使用LC/MS-MS法檢測人血漿，尿液和其他生物制品中多粘菌素E1的含量，固相萃取技術(shù)可除去生物樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)，得到較干凈的樣品用于分析，但是固相萃取板價格昂貴，使得實驗成本大大提高。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC/MS-MS）由于其分析時間短，靈敏度高，近年來也被常用于多粘菌素E藥動學(xué)研究，Miao Zhao[9]等采用弱離子交換固相萃取板對樣品進(jìn)行前處理，開發(fā)并驗證了UPLC/MS-MS法檢測人血漿和尿液中多粘菌素的含量的方法。Giuliana Cangemi[10]等采用蛋白沉淀的前處理方式開發(fā)了UPLC/MS-MS法檢測人血漿中多粘菌素E含量的方法。

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血漿中多粘菌素E1的生物分析方法。樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，取上清液分析，結(jié)果表明，多粘菌素E1的線性范圍是200～2000 ng/mL，定量下限為200 ng/mL，而有文獻(xiàn)報道為28 ng/mL甚至更高[8]，因此本方法定量下限更低；在人血漿中多粘菌素E1的提取回收率在1003%～1135%之間，批內(nèi)批間精密度均不大于42%；多粘菌素E1血漿樣品可在濕冰中穩(wěn)定至少18小時，可穩(wěn)定至少4次凍融循環(huán)。本研究優(yōu)化了高效液相色譜、質(zhì)譜條件，同時采用了最為優(yōu)化的蛋白沉淀提取方式，與固相萃取等前處理方法相比，操作簡便易行，技術(shù)難度低，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性良好，同時又節(jié)約成本，經(jīng)方法學(xué)驗證，本研究所建立的LC-MS/MS方法具有選擇性，準(zhǔn)確性，精密性，且穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)規(guī)定，可用于大量人血漿樣品中多粘菌素E1的分析。

參考文獻(xiàn)

[1]畢言鋒，汪霞，何家康。超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物組織中阿莫西林與多粘菌素E的殘留量（J）.分析測試學(xué)報，2011，30（8）：864-867

[2]Orwa J A，Van Gerven A，Roets E，Hoogmartens J.Development and validation of a liquid chromatography method for analysis of colistin sulphate〔J〕.Chromatographia，2000，51：433-436

[3]肖希龍，林斌，張純萍。硫酸多粘菌素E注射液及其藥物動力學(xué)研究 （J）.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（3）：329-335

[4]王影， 李艷然， 韓鐫竹， 等。 多黏菌素耐藥性的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報， 2017， 44（1）：200-206

[5]Evans M E ， Feda D J ， Rapp R P.Polymyxin B sulfate and colistin：old antibiotics for emerging multi resistant gram-negative bacteria.Ann .Pharmacother ， 1999 ， 33（9）：960 -967 .

[6]吳水華，尤潔，柯伙釗，王翠，陳梁軍。多粘菌素E檢測方法的研究新進(jìn)展（J）.Strait Pharmaceutical Journal Vol ，2014，26（4）：15-17

[7]Jian Lia，Robert W.Milne，Roger L.Nation， et al.A simple method for the assay of colistin in human plasma，using pre-column derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate in solid-phase extraction cartridges and reversed-phase high-performance liquid chromatography〔J〕.J.Chromatography B，2001，761： 167-175

[8]Zheng Ma， Jiping Wang， Jacobus P.Gerber， et al.Determination of colistin in h-uman plasma，urine and other biological samples using LC-MS /MS〔J〕.Journal of Chromatography B，2008，862： 205-212

[9]Miao Zhao， Xiao-Jie Wu， Ya-Xin Fan，et al.Development and validation of a UHPLC-MS/MS assay for colistin methanesulphonate （CMS） and colistin in human plasma and urine using weak-cation exchange solid-phase extraction Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 124 （2016） 303-308

[10]Giuliana Cangemia， Sebastiano Barc， Elio Castagnola， et al.Development and validation of UHPLC-MS/MS methods for thequantification of colistin in plasma and dried plasma spots〔J〕.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 129 （2016） 551-557