MicroRNA-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

李文輝 呂博文 錢(qián) 鈞 蘇麗菊 楊桐樹(shù) 錢(qián)景榮 王 杰

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性癌癥相關(guān)死亡原因中位居第四。由于缺乏有效的早期篩查手段，早期癥狀及臨床表現(xiàn)不典型，約85%的患者初診時(shí)已屬疾病晚期錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)期。最新統(tǒng)計(jì)資料顯示[1-3]，近10年來(lái)，卵巢癌患者死亡率仍然較高，5年生存率沒(méi)有明顯改善。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常見(jiàn)也是死亡率最高的病理類(lèi)型，其死亡率高于其他各類(lèi)婦科腫瘤之和[4-5]。截止目前，上皮性卵巢癌發(fā)生進(jìn)展中的分子機(jī)制仍不完全清楚，給卵巢腫瘤的早期診斷帶來(lái)困難和挑戰(zhàn)。因此，尋找與上皮性卵巢癌發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵因子，對(duì)提高上皮性卵巢癌患者生存率至關(guān)重要。

MicroRNA(miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA，其通過(guò)與目標(biāo)信使RNA(mRNA)3′UTR區(qū)不完全結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[6-7]。miRNA參與調(diào)控機(jī)體多種生理和病理過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，它們與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。一些miRNA，如miR-455、miR-494、miR-520b，可作為癌基因或抑癌基因在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在上皮性卵巢癌組織中存在差異表達(dá)，可能是潛在的調(diào)控分子[11]，但miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前尚不清楚。本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法檢測(cè)miR-150在正常卵巢上皮細(xì)胞和上皮性卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)差異及其對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Quant一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；流式細(xì)胞術(shù)所用FITC標(biāo)記的Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；Transwell實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人正常卵巢上皮細(xì)胞系T29胞、上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和OVCAR3細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人正常卵巢細(xì)胞(T29)和上皮性卵巢癌細(xì)胞(A2780，OVCAR3)置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)上皮性卵巢癌細(xì)胞密度達(dá)到約70%后，將miR-150無(wú)義序列(miR-150NC)和miR-150類(lèi)似物(miR-150mimic)經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，具體操作步驟參見(jiàn)脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000)試劑說(shuō)明。將細(xì)胞分為3組：Blank組(空白對(duì)照組)、miR-150 NC組(轉(zhuǎn)染miR-150NC細(xì)胞組)及miR-150 mimic組(轉(zhuǎn)染miR-150 mimic細(xì)胞組)。

1.2.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，然后采用Quant一步法逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒所述方法行qRT-PCR，具體步驟如下：按說(shuō)明書(shū)所述依次加入試劑后行一步法qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30 min，95℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)94℃ 20 s，60℃20 s，65℃ 20 s。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上皮性卵巢癌細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以5.0×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，設(shè)置miR-150 mimic組、miR-150 NC組、Blank組三組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)1～3 d，每孔加入20 μL濃度為1.5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，讀取吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，5 mL PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，5 mL PBS洗滌3次后，棄上清液；加入100 μL流式洗液，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Annexin-V和7-AAD各10 μL及同型對(duì)照抗體，避光反應(yīng)10 min后，加入400 μL流式洗液，200目尼龍膜過(guò)濾細(xì)胞后立即用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)后期采用Flowjo7.2軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞，以2×108個(gè)細(xì)胞接種于Matrigel膠包被的Transwell小室，37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，去除濾膜上室面的細(xì)胞和Matrigel膠，將細(xì)胞與1%多聚甲醛混合固定后染色，用顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 上皮性卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞中miR-150的表達(dá)差異

qRT-PCR結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和OVCAR3中miR-150的表達(dá)量分別為(A2780：0.41±0.05；OVCAR3：0.34±0.07)，明顯低于正常卵巢上皮細(xì)胞系T29(1.79±0.23)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

2.2 miR-150 mimic上調(diào)上皮性卵巢癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)

在轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-150 mimic組 miR-150 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Blank組和miR-150 NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且miR-150 NC組與Blank組之間miR-150相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-150 mimic可上調(diào)上皮性卵巢癌細(xì)胞中 miR-150 的表達(dá)水平(圖2)。

圖1 正常人卵巢上皮細(xì)胞T29和上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、OVCAR3中miR-150的相對(duì)表達(dá)水平Figure 1 The expression of miR-150 in human ovarian epithelial T29 cells and epithelial ovarian cancer(A2780 and OVCAR3)cellsNote：**P<0.01，compared with the T29 cells group.

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-150的相對(duì)表達(dá)水Figure 2 The expression of miR-150 in A2780 and OVCAR3 cells after miR-150 mimic transfectionNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

2.3 miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

為研究miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響，利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組細(xì)胞的增殖差異。結(jié)果顯示，miR-150 mimic組細(xì)胞OD值在各時(shí)間點(diǎn)均較miR-150 NC組及Blank組降低，轉(zhuǎn)染后第三天，miR-150 mimic組OD值(A2780：1.12±0.03；OVCAR3：1.91±0.03)明顯低于Blank組(A2780：2.35±0.09；OVCAR3：2.63±0.07)和miR-150 NC組(A2780：2.18±0.07；OVCAR3：2.43±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Blank組與miR-150 NC組OD值相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，提高上皮性卵巢癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖(圖3)。

2.4 miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

為研究miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡水平的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組細(xì)胞的凋亡情況的差異。結(jié)果顯示，miR-150 mimic組細(xì)胞凋亡率(A2780：16.10±0.58%；OVCAR3：15.16±1.30%)明顯高于Blank組(A2780：10.07±0.66%；OVCAR3：3.81±0.24%)和miR-150 NC組(A2780：10.36±1.08%；OVCAR3：4.89±0.07%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Blank組與miR-150 NC組凋亡率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，上調(diào)上皮性卵巢癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平可促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)miR-150是潛在的腫瘤抑制分子(圖4)。

2.5 miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

為研究miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的差異。結(jié)果顯示，miR-150 mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)(A2780：38.67±2.03；OVCAR3：28.67±2.03個(gè))，明顯低于Blank組(A2780：76.30±7.45；OVCAR 3：55.67±3.18個(gè))和miR-150 NC組(A2780：74.33±5.78；OVCAR3：56.33±3.84個(gè))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A2780：F=14.49，P<0.01；OVCAR3：F=25.77，P<0.01)；Blank組與miR-150 NC組穿膜細(xì)胞數(shù)相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，上調(diào)上皮性卵巢癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(圖5)。

圖3 miR-150表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effects of miR-150 expression on the proliferation of epithelial ovarian cancer cellsNote：A.The proliferation of A2780 cell；B.The proliferation of OVCAR3 cell；*P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

圖4 miR-150表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effects of miR-150 expression on apoptosis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

圖5 miR-150表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響Figure 5 Effects of miR-150 expression on invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

3 討論

上皮性卵巢癌因其惡性程度高、缺乏有效早期檢查手段，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病晚期，且5年生存率低，已經(jīng)成為困擾婦科腫瘤治療的主要問(wèn)題之一。目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示，上皮性卵巢癌中存在多種差異表達(dá)的miRNA，這些差異表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中包括細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12-13]。因此，揭示上皮性卵巢癌中miRNA的作用及機(jī)制對(duì)克服這種致命疾病至關(guān)重要。

以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在多種腫瘤中差異表達(dá)，通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程，影響腫瘤的發(fā)展。在甲狀腺癌中，miR-150通過(guò)抑制RAB11A/WNT/β-連環(huán)蛋白途徑在體內(nèi)外抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]；在結(jié)腸癌中，miR-150通過(guò)靶向調(diào)節(jié)MUC4抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[15]；在原發(fā)性肝癌中，低水平的miR-150與肝癌患者預(yù)后較差顯著相關(guān)[16]；在肺癌中高表達(dá)的miR-150抑制S激酶信號(hào)抑制劑1的表達(dá)，使得肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移增加[17]；在宮頸癌中，miR-150通過(guò)靶向FOXO4促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。

目前，miR-150在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及功能研究較少。有研究顯示，在上皮性卵巢癌組織中，miR-150表達(dá)水平較正常卵巢上皮組織降低[19]，但其對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)活性影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用qRT-PCR、MTT、流式細(xì)胞技術(shù)、Transwell等方法，研究miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。與以往研究相符，miR-150在上皮性卵巢癌中表達(dá)下降；此外，上調(diào)miR-150表達(dá)后，通過(guò)觀察上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移侵襲能力我們發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖減少，凋亡增加，轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯下降。由此我們推測(cè)：miR-150表達(dá)減少可能是上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一；miR-150可作為抑癌基因，調(diào)控上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移侵襲能力。

本研究目前僅在細(xì)胞水平驗(yàn)證了miR-150對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，下一步，我們將進(jìn)行miR-150靶蛋白的驗(yàn)證，明確miR-150水平與上皮性卵巢癌患者臨床進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系；未來(lái)我們還將著重進(jìn)行上皮性卵巢癌中miR-150失調(diào)機(jī)制的探討。miR-150及其靶蛋白的相關(guān)研究有望為上皮性卵巢癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估及臨床治療提供新的靶點(diǎn)。