鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞增殖及自噬流的影響

劉雅菁 劉國鈺 王樹濱 方征宇

黑色素瘤是黑色素細胞惡性轉(zhuǎn)化形成的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚[1-2]，是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3%～5%[3]。因其惡性程度極高，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，早期診斷、早期治療非常重要[4-5]。在過去三年中，針對黑色素瘤的靶向治療和免疫治療發(fā)展迅速，致死率降低[6]。但黑色素瘤細胞極易產(chǎn)生耐藥性[7]，進而影響治療效果，出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，成為目前黑色素瘤治療應(yīng)用中十分棘手的問題。因此，亟需發(fā)現(xiàn)治療黑色素瘤的新型藥物或輔助藥物。文獻報道鹽霉素能夠特異性殺傷乳腺癌干細胞[8]，且對多種腫瘤細胞有殺傷作用[9-13]。但在黑色素瘤中的研究非常之少，對其機制的研究也尚無報道。本文選取人黑色素瘤經(jīng)典細胞株M21細胞，檢測鹽霉素對其增殖的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人黑色素瘤M21細胞株(廣州吉妮歐生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(100 mg/mL鏈霉素、100 mg/mL青霉素)(美國GIBCO公司)；鹽霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；DMSO(美國Sigma公司)；MTS液(美國Promega公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS蛋白裂解液、蛋白Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔源LC3B抗體、兔源p62抗體、兔源B2M抗體、鼠抗兔二抗、鼠抗兔熒光二抗(美國CST公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人黑色素瘤M21細胞株采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞放置于37℃，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞后進行傳代，實驗取對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞株對鹽霉素敏感性實驗

將人黑色素瘤M21細胞接種到96孔板中，每孔3000個細胞，接種24 h后分別給予濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0 μM的鹽霉素，每種濃度設(shè)置三個復(fù)孔。藥物作用72 h后，加入MTS工作液20 μL，37℃孵育1 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞生存率=(OD加藥組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%，利用細胞生存率計算半數(shù)抑制濃度(Half inhibitory concentration，IC50)。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

將M21細胞接種于6孔板中，貼壁后加入1.0 μM鹽霉素處理細胞。在藥物處理0 h、12 h、24 h、48 h后收集細胞。用不含EDTA的胰酶消化后用PBS清洗兩次，收集細胞。按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明書標記細胞后，用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達情況

收集1.0 μM鹽霉素分別作用0 h、12 h、24 h、48 h后的M21細胞，加入適量的蛋白裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進行定量，蛋白上樣10%聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用3%BSA溶液于常溫下封閉30 min，分別加入稀釋過的一抗，4℃孵育過夜。次日洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗滌后加入顯影劑并通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.6 透射電鏡樣品的準備與前固定

M21細胞經(jīng)1.0 μM鹽霉素作用0 h、48 h后，用PBS洗滌細胞，將細胞刮下收集到離心管中。立即加入2.5%電鏡用戊二醛0.5 mL固定，勿吹懸，室溫固定1 h，4℃固定3 h，去除戊二醛加滿PBS放置4℃待送檢。將樣品送至廣州南方醫(yī)科大學電鏡室，經(jīng)過脫水、浸透、包埋聚合、切片、染色等步驟，在透射電鏡下觀察。

1.7 免疫熒光觀察p62蛋白的表達和定位

接種適量M21細胞到細胞爬片，貼壁后加入1.0 μM鹽霉素分別作用0 h、48 h。室溫PBS清洗后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，可在搖床上輕搖。加入封閉液(10%山羊血清+0.1% Triton-X100+PBS)，封閉30 min。加入一抗，4℃孵育過夜。PBS搖蕩沖洗3次，每次10 min。加入熒光二抗，室溫孵育2 h。PBS清洗后，加入1×DAPI，室溫染色5 min，用雙蒸水清洗一次。晾干封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達和分布情況。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞增殖的影響

MTS檢測結(jié)果顯示，鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞具有明顯的增殖抑制作用，在一定范圍內(nèi)細胞生存率隨鹽霉素濃度的增加而降低(P<0.05)。人黑色素瘤M21細胞對鹽霉素極其敏感，IC50值僅為(1.38±0.18)μM(圖1)。

2.2 鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞形態(tài)的影響

光學顯微鏡下觀察1.0 μM鹽霉素處理人黑色素瘤M21細胞不同時間后細胞的形態(tài)變化。正常M21細胞貼壁生長，分裂速度非常快，形態(tài)規(guī)則呈多邊形。給藥后，細胞分裂增殖速度減慢，形態(tài)變得不規(guī)則，繼而變圓脫落，細胞漿內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)形成，空泡會逐漸變多且變大(圖2)。

2.3 鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞凋亡的影響

為了研究鹽霉素對M21細胞凋亡的影響，采用流式細胞儀檢測鹽霉素分別作用0 h、12 h、24 h、48 h后細胞凋亡的情況。結(jié)果可見隨作用時間增加，凋亡細胞數(shù)量先增加后些許降低，但占總細胞數(shù)的百分比均較低，表明鹽霉素僅能促進少量M21細胞發(fā)生凋亡，凋亡并不是鹽霉素引起大量M21細胞死亡的主要作用機制(圖3)。

圖3 流式檢測不同時間點鹽霉素誘導細胞凋亡情況Figure 3 Salinomycin induced cell apoptosis in M21 cells at different time pointsNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

圖2 1.0 μM鹽霉素作用M21細胞不同時間后細胞形態(tài)圖(×200)Figure 2 The effect of salinomycin(1.0 μM)on morphological changes of M21 cells

2.4 鹽霉素對自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達的影響

考慮到鹽霉素作用后細胞內(nèi)有空泡產(chǎn)生，猜測死亡機制可能與自噬有關(guān)。于是檢測了自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達。與對照組相比，加藥組LC3B-Ⅰ蛋白表達水平隨處理時間增加而降低。LC3B-Ⅱ蛋白在給藥12 h時表達水平略有降低，之后逐漸增加。同時LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值也隨處理時間增加而明顯增加。與對照組相比，各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 1.0 μM鹽霉素作用后M21細胞內(nèi)LC3B蛋白表達水平Figure 4 The expression of LC3B in M21 cells after treated with 1.0 μM salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

2.5 鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞自噬的影響

在電鏡下直接看到自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)是檢測自噬發(fā)生的金標準[14]。圖5中可看到1.0 μM鹽霉素處理48 h后M21細胞內(nèi)形成了許多自噬小體(特征為具有雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含細胞器和胞漿成分)，且出現(xiàn)大面積的空泡化。各結(jié)構(gòu)放大圖見圖5右側(cè)。

圖5 電鏡下觀察1.0 M鹽霉素對M21細胞自噬的影響Figure 5 The effect of salinomycin on autophagy in M21 cells

2.6 鹽霉素對自噬特異性底物p62蛋白的影響

p62蛋白水平變化可以指示自噬流變化情況。由圖6A可以看出，隨著1.0 μM鹽霉素作用時間增加，p62蛋白水平也有些許增加。為進一步驗證p62蛋白的變化情況，進行了免疫熒光檢測。由圖6B所示，鹽霉素作用后p62蛋白水平升高且逐漸在細胞質(zhì)內(nèi)聚集呈團狀。

圖6 1.0 M鹽霉素對自噬特異性底物p62蛋白表達水平及定位的影響Figure 6 The expression level and localization of p62 protein in M21 cells treated with salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

3 討論

已有研究結(jié)果顯示鹽霉素不僅能對乳腺癌干細胞有特異性殺傷作用[8]，且對卵巢癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細胞均有較強的殺傷作用[9-13]。但其殺傷腫瘤細胞的作用機制各不相同[15]，已發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠通過抑制Akt/NF-κB信號通路、升高細胞內(nèi)ROS水平誘導細胞發(fā)生凋亡[9-10]，能夠通過ROS-AMPK-mTOR途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙誘導細胞產(chǎn)生自噬[11-12]，還能夠誘導細胞發(fā)生壞死[13]。但目前還未見有關(guān)于鹽霉素作用于黑色素瘤的具體機制研究。

在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)鹽霉素對人黑色素瘤M21細胞具有明顯的增殖抑制作用，IC50值僅為(1.38±0.18)μM。同時發(fā)現(xiàn)隨著1.0 μM鹽霉素作用時間增加，細胞不僅增殖速度變慢，而且胞內(nèi)產(chǎn)生了空泡樣結(jié)構(gòu)，逐漸增多變大。因此猜測鹽霉素抑制人黑色素瘤M21細胞增殖的作用機制可能與自噬有關(guān)。

有文章報道鹽霉素可以誘導某些細胞發(fā)生自噬，起到促進生存的作用，并減弱凋亡過程[16]。而一些研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠誘導異常自噬流，進而激活細胞凋亡的相關(guān)通路[17]。于是我們檢測了自噬相關(guān)蛋白LC3B的水平變化，發(fā)現(xiàn)鹽霉素可以誘導LC3B-Ⅱ蛋白水平和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的升高，即自噬小體的增多。因為在電鏡下直接看到自噬小體是檢測自噬發(fā)生的金標準，所以我們進行了電鏡檢測，進一步確證了自噬小體的存在，同時發(fā)現(xiàn)自噬小體增多繼而導致堆積。

但自噬小體的增多可能歸結(jié)于兩種截然不同的因素，一是自噬流的增加，自噬小體增多最終會被溶酶體降解，二是自噬小體無法被降解，導致自噬小體越積越多[18]。同時有研究結(jié)果顯示，在某些細胞中鹽霉素能夠引起自噬產(chǎn)生，導致細胞過度自噬[19]，而其他研究中發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠抑制自噬流，導致自噬小體堆積無法降解而引起細胞死亡[10-11]。在本研究中p62蛋白作為自噬特異性底物[20]，不僅其表達水平隨時間增加且在自噬小體中逐漸聚集呈團狀，表明自噬小體未被溶酶體降解，細胞內(nèi)自噬流被抑制，從而導致自噬小體在細胞內(nèi)堆積，最終引起細胞死亡。

綜上所述，鹽霉素具有抑制人黑色素瘤M21細胞增殖的作用，其機制可能與誘導自噬小體增多、抑制細胞內(nèi)自噬流有關(guān)，但具體分子機制需進一步進行研究。本研究結(jié)果為鹽霉素在黑色素瘤中的作用機制增添了新的研究結(jié)果，為鹽霉素的進一步研究與臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有臨床應(yīng)用潛力。