生姜中姜黃素的勻漿結(jié)合有機(jī)溶劑法提取工藝優(yōu)化

蔡婧婧，唐曉珍，位思清，孫彩翼，王雪，孫靜雯，李寧陽＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018；2.山東省外貿(mào)職業(yè)學(xué)院，山東 泰安 271000）

姜黃素是聯(lián)合國糧農(nóng)組織食品法典委員會(huì)批準(zhǔn)的食品添加劑（FAO/WHO，1995），主要用于罐頭、腸類、醬鹵制品、糕點(diǎn)、飲料等的染色［1］。醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，姜黃素具有保肝利膽、降血脂、抗癌、消炎殺菌、抗氧化、防止衰老等多方面藥理作用［2－8］。由于姜黃素在食品和醫(yī)療領(lǐng)域的功效，市場(chǎng)上對(duì)姜黃素的需求日益擴(kuò)增，根據(jù)Grand市場(chǎng)研究公司最新的研究證實(shí)，歐洲作為姜黃素的主要消費(fèi)區(qū)，預(yù)計(jì)姜黃素市場(chǎng)從2015年～2022年將以每年超過17%的年增長率增長，全球姜黃素市場(chǎng)預(yù)計(jì)到2022年將達(dá)到9430萬美元［9－11］。

中國是世界生姜生產(chǎn)大國，生姜總種植面積為25.65萬公頃，總產(chǎn)量為580萬噸，占世界總產(chǎn)量的38.32%［12］。姜黃作為提取姜黃素的主要原料之一，含量為0.55%～4.90%［13－15］，生姜中也含有大量姜黃素，含量為0.39%～3.35%［16－18］，接近姜黃中姜黃素，資料顯示二者姜黃素組分類似［19］。姜黃畝產(chǎn)約為1000kg［20］，而生姜畝產(chǎn)約為5000～7500kg，是姜黃產(chǎn)量的5～8倍，若能用生姜中姜黃素代替姜黃中姜黃素，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。

目前姜黃素常見的提取方法有有機(jī)溶劑提取法、酸堿提取法、超臨界CO2萃取法、水楊酸鈉法、酶提取法［21－25］。有機(jī)溶劑提取法設(shè)備簡單、操作方便，為姜黃素的常用提取方法；勻漿法具有提取速度快、溫度低、能耗低、目的成分含量高等優(yōu)點(diǎn)［26］，且鮮物料勻漿法特別適合于熱敏性物質(zhì)的提取。二者結(jié)合具有提取速度快，能耗低，在常溫下均能對(duì)干物料和濕物料進(jìn)行提取，目的成分穩(wěn)定性較好，目的成分高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常作為初級(jí)提取方法，得到粗提物后進(jìn)行后續(xù)提取純化。為此，本試驗(yàn)以山東安丘大姜為研究對(duì)象，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化勻漿法提取生姜的條件，采用分光光度法測(cè)定姜黃素的含量，以期為生姜中姜黃素資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山東安丘生姜：2016年4月份采收；無水乙醇：天津凱通有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子天平 上海上平儀器有限公司；國華JJ－1數(shù)顯精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國華電器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

據(jù)參考文獻(xiàn)［18］繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

式中：x為樣品的吸光度值（425nm）；y為姜黃素的含量（mg/g）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

取生姜5份，每份100g。固定料液比1∶4（g/mL）、勻漿時(shí)間3min、攪拌時(shí)間30min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，70%，80%，90%，100%對(duì)含量的影響。然后將優(yōu)選的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)作為固定數(shù)值，考察料液比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（g/mL）、攪拌時(shí)間0，10，20，30，40min、勻漿時(shí)間0，1，2，3，4min對(duì)含量的影響，逐次篩選各因素的最佳條件。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design Expert軟件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳試驗(yàn)條件并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.3.4 姜黃素含量的確定

參照參考文獻(xiàn)［26］，公式如下：

式中：Y為姜黃素的含量（mg/g），C為姜黃素的濃度（mg/mL），V為用乙醇提取的姜黃素的體積（mL），M 為生姜的質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)姜黃素含量的影響Fig.1Effect of ethanol volume fraction on curcumin content

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，60%～90%呈顯著性增長（p＜0.05），90%～100%增長不顯著（p＞0.05）。這說明乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，姜黃素已經(jīng)被充分提取，因此確定最佳體積分?jǐn)?shù)為90%。

2.2 勻漿時(shí)間的選擇

圖2 勻漿時(shí)間對(duì)姜黃素含量的影響Fig.2Effect of homogenization time on curcumin content

由圖2可知，0～3min時(shí)，姜黃素含量隨著時(shí)間的增長呈顯著性增長（p＜0.05），3min時(shí)姜黃素含量達(dá)到最大值2.23%，塊狀生姜在勻漿機(jī)的剪切作用下進(jìn)一步破碎，形成了大量的組織團(tuán)塊、細(xì)胞團(tuán)塊和破損細(xì)胞，隨著勻漿時(shí)間的增長，細(xì)胞破碎度越大，提高了細(xì)胞內(nèi)姜黃素向提取介質(zhì)乙醇擴(kuò)散的效率，從而提高了姜黃素的溶出率［27］。3min之后顯著性下降（p＜0.05），此時(shí)生姜粉碎過細(xì)，勻漿液呈糊狀，反而降低了姜黃素的傳質(zhì)速度，因此確定最佳勻漿時(shí)間為3min。

2.3 攪拌時(shí)間的選擇

圖3 攪拌時(shí)間對(duì)姜黃素含量的影響Fig.3Effect of stirring time on curcumin content

由圖3可知，隨著攪拌時(shí)間增長，10～30min姜黃素含量顯著性提高（p＜0.05），這是因?yàn)橐掖紡纳?xì)胞壁滲透到細(xì)胞內(nèi)并完全溶解出姜黃素需要一定時(shí)間，在30min時(shí)姜黃素被充分提取，細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到了動(dòng)態(tài)的平衡，提取液呈飽和狀態(tài)。超過30min后，含量增加不顯著（p＞0.05），40min后開始緩慢下降（p＜0.05），這可能是因?yàn)橐掖际且讚]發(fā)物質(zhì)，隨著時(shí)間延長，乙醇揮發(fā)使得姜汁濃度增加，影響姜黃素含量，因此確定最佳攪拌時(shí)間為30min。

2.4 料液比的選擇

圖4 料液比對(duì)姜黃素含量的影響Fig.4Effect of the ratio of material to liquid on curcumin content

由圖4可知，隨著料液比的增加，姜黃素的含量呈顯著性上升趨勢(shì)（p＜0.05），當(dāng)料液比達(dá)到1∶4之后增長不顯著，這是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到一定程度后，姜黃素已經(jīng)基本溶解在溶劑中提取完全，因此確定最佳料液比為1∶4。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、攪拌時(shí)間、勻漿時(shí)間、料液比4個(gè)因素為自變量，以姜黃素含量為響應(yīng)值，做四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of response surface design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2Scheme and experimental results of response surface design

2.5.2 回歸模型的建立及檢驗(yàn)

對(duì)27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3Response surface experimental results analysis of variance

續(xù) 表

由表3可知，回歸模型是極顯著的（P＜0.0001），模型失擬項(xiàng)是表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不符合的概率，該模型失擬項(xiàng)P值為0.1762，表示失擬不顯著，該模型可以反映響應(yīng)值的變化，對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

因素B、因素D的P值均小于0.0001，說明勻漿時(shí)間和料液比的影響是極顯著的，同時(shí)A2，B2，C2，D2的P值均小于0.01，說明 A2，B2，C2，D2的影響是極顯著的，說明C2的影響是顯著的。

交互項(xiàng)AB的P值＜0.01，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和勻漿時(shí)間交互項(xiàng)對(duì)含量有極顯著影響，AD的P值＜0.05，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間的交互作用對(duì)含量是有顯著影響的，AC，BC，BD，CD的P值均大于0.05，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和攪拌時(shí)間、勻漿時(shí)間和攪拌時(shí)間、勻漿時(shí)間和料液比、攪拌時(shí)間和料液比之間交互項(xiàng)對(duì)含量是沒有顯著影響的。

對(duì)表3進(jìn)行多元回歸擬合，得到姜黃素的含量對(duì)自變量A，B，C，D的二次多項(xiàng)回歸方程：y＝＋2.1＋0.065A＋0.31B－4.167E－003C－0.18D＋0.18AB＋0.047AC－0.12AD－0.050BC－0.11BD－0.060CD－0.23A2－0.41B2－0.15C2－0.27D2。

2.5.3 變異系數(shù)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)Table 4Coefficient of variation of response surface experimental results

校正決定系數(shù)R2（Adj）為0.7581，變異系數(shù)C.V.（%）為6.16%，說明該模型6.16的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性較好。

2.5.4 等值線圖和三維分析面圖

借助Design Expert軟件來繪制交互作用分析圖，見圖5。

圖5 兩因素交互作用對(duì)姜黃素含量影響的等高線和響應(yīng)面Fig.5Response surface and contour plots showing two factors＇interaction effects on the yield of curcumin

從等值線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。

由圖5響應(yīng)面立體圖和等高線圖可知：圖5A中等高線圖形趨于橢圓，乙醇體積分?jǐn)?shù)和勻漿時(shí)間交互作用對(duì)含量有極顯著影響；圖5B中等高線圖形趨于橢圓，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間的交互作用對(duì)含量有顯著影響；圖5C，5D，5E，5F中等高線圖形趨于圓形，勻漿時(shí)間和攪拌時(shí)間、勻漿時(shí)間和料液比、攪拌時(shí)間和料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和攪拌時(shí)間交互作用不顯著。

圖5A（b）響應(yīng)面隨著勻漿時(shí)間的增加含量先增大后降低，變化幅度較小；隨乙醇體積分?jǐn)?shù)先增大后趨于平緩且變化幅度較大。這主要是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)越大越有利于姜黃素的溶解，在最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)姜黃素已經(jīng)得到充分提取；適當(dāng)?shù)靥岣邉驖{時(shí)間可以提高姜黃素的含量，當(dāng)勻漿時(shí)間高于最佳勻漿時(shí)間時(shí)，生姜粉碎過細(xì)，提取液呈糊狀，影響了傳質(zhì)速度。因此提取姜黃素時(shí)要選擇合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)和勻漿時(shí)間。

回歸模型預(yù)測(cè)總姜黃素含量最優(yōu)時(shí)的乙醇濃度為93.38%，勻漿時(shí)間為3.49min，攪拌時(shí)間為30.01min，料液比為1∶4，姜黃素含量為2.34mg/g。按照該條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，為方便操作，設(shè)置乙醇濃度為90%，勻漿時(shí)間為3.5min，攪拌時(shí)間為30min，料液比為1∶4，3次平行試驗(yàn)姜黃素的平均含量為2.27mg/g。

3 結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化勻漿結(jié)合有機(jī)溶劑法提取生姜中姜黃素的提取工藝為：乙醇濃度90%，攪拌時(shí)間30min，勻漿時(shí)間3.5min，料液比1∶4，在此條件下姜黃素的含量為2.27mg/g，與預(yù)測(cè)值2.34mg/g基本吻合。