三七總皂苷對(duì)杠柳毒苷藥代動(dòng)力學(xué)的影響*

劉華明，李　麗，馬文娟，賈　琪，歐陽(yáng)慧子，何　俊

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

香加皮（Cortex Periplocae），又名北五加皮、杠柳皮，是蘿藦科植物杠柳（Periploca Sepium Bge）的干燥根皮[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中國(guó)藥典》自1977年起均有收載[2]。杠柳毒苷為香加皮的主要有效、有毒成分，經(jīng)口服代謝后可轉(zhuǎn)化成杠柳次苷和杠柳苷元[3]。研究表明，杠柳毒苷具有強(qiáng)心[4]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]等藥理作用，同時(shí)也具有一定的毒副作用，過(guò)量使用會(huì)出現(xiàn)室性早博、心室顫動(dòng)、心房顫動(dòng)、房室傳導(dǎo)阻滯等不良反應(yīng)[6]，臨床主要用于風(fēng)濕、慢性充血性心力衰竭和心源性水腫的治療[7]。目前，國(guó)內(nèi)外已有研究采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）法[8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）[9]法測(cè)定大鼠血漿中杠柳毒苷的含量，但HPLC-UV法的專屬性差、靈敏度低，易受血漿內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾；而在本課題組已報(bào)道的LC-MS/MS法[9]中，本研究采用單次灌胃給藥的方式，結(jié)果顯示杠柳毒苷的代謝物杠柳次苷和杠柳苷元存在一定的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，但原型藥物杠柳毒苷的藥動(dòng)學(xué)行為仍舊不清晰。因此，為了更加深入了解杠柳毒苷在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程，本研究對(duì)原有的LC-MS/MS法進(jìn)行了優(yōu)化，使其能應(yīng)用于配伍給藥方式的藥動(dòng)學(xué)研究，希望能夠闡明不同配伍比例的三七總皂苷對(duì)杠柳毒苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程的影響，為臨床上香加皮配伍三七提供藥動(dòng)學(xué)理論依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)，Agilent公司）；Agilent 6430三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)，Agilent公司）；Agilent MassHunter分析軟件（美國(guó)，Agilent公司）；AX 205型十萬(wàn)分之一天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；3K15型高速離心機(jī)（美國(guó)，Sigma公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2試藥杠柳毒苷（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DST170907-041，純度≥98%）；補(bǔ)骨脂素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110739-201416，純度≥98%）；三七總皂苷（成都德思特生物技術(shù)有限公司，其中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和 Rg1 總量大于65%）；色譜純甲醇、色譜純乙腈（美國(guó)Thermo Fisher Scientific Inc）；甲酸（美國(guó)ROE scientific Inc.）；分析純乙酸乙酯（天津康科德科技有限公司）；超純水自制。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥方式健康雄性SD大鼠（220～230）g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.11401300070656，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。18只大鼠被分為杠柳毒苷單獨(dú)給藥組（A組）、杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組（B組）、杠柳毒苷和高劑量三七總皂苷配伍組（C組）。杠柳毒苷給藥劑量為10mg/（kg·d），三七總皂苷給藥量分別為0.74g/（kg·d）和2.22 g/（kg·d）（分別相當(dāng)于香加皮和三七的比例為 1∶1 和 1∶3，前期實(shí)驗(yàn)獲得的換算因子為 8.11）。采用灌胃給藥的方式，連續(xù)給藥7 d。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters CORTECSTM C18柱（2.1 mm×50 mm,2.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-0.1%甲酸水（A）；梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～7 min，19%～50%B；7～9 min，50% ～50%B；洗脫時(shí)間 9 min；流速為 0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI），檢測(cè)模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），正離子監(jiān)測(cè)；Delta EMV（＋）：500 V；Gas Temp：300 ℃；Gas Flow：11 L/min；Nebulizer：15 psi。杠柳毒苷定量離子對(duì)為719.4→719.4，碎裂電壓135 V，碰撞能量3 V；內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素定量分析離子對(duì)為187.0→131.1，碎裂電壓115 V，碰撞能量25 V。

2.3溶液的配制

2.3.1杠柳毒苷標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱取杠柳毒苷10.03mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，配制為1.003 mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞芰咳∫欢w積的杠柳毒苷儲(chǔ)備液，用甲醇依次稀釋成質(zhì)量濃度為 5、10、25、50、125、500、2 000、2 500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

2.3.2內(nèi)標(biāo)溶液量取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.01 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋為1.001 mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。量取一定的補(bǔ)骨脂素儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

2.4血漿樣品預(yù)處理精密量取血漿樣品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液 20 μL（補(bǔ)骨脂素，1 μg/mL），20 μL 甲醇，渦旋混勻，再加入2mL乙酸乙酯渦流振蕩5min，14 000 r/min離心10 min后，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈?，?00 μL 50%甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩5 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液5 μL進(jìn)行LCMS/MS分析。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1專屬性精密量取空白血漿100 μL，加甲醇40 μL，其他按2.4項(xiàng)下處理并取上清進(jìn)樣分析，得色譜圖1（A）；將一定濃度的杠柳毒苷對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依同法處理，得色譜圖1（B）；取大鼠灌胃后的血漿樣品，依同法處理，得色譜圖1（C）。杠柳毒苷和內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間分別是3.35 min和4.31 min。血漿樣品中內(nèi)源性成分目標(biāo)性成分互不干擾，結(jié)果如圖1。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍精密量取大鼠空白血漿100 μL，加入一系列濃度的杠柳毒苷對(duì)照品溶液20 μL，再加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液后，配制成血漿中杠柳毒苷濃度分別為 1、2、5、10、25、100、400、500 ng/mL的血漿樣品，按照2.4項(xiàng)下的血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，取上清液進(jìn)行分析并記錄色譜圖，以杠柳毒苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y?）為縱坐標(biāo)，杠柳毒苷的濃度（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，權(quán)重系數(shù)為1/X，獲得杠柳毒苷的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（Y?=0.129 565X-0.000 347 821 1，r=0.994 9），以 S/N≥10 為標(biāo)準(zhǔn)，杠柳毒苷的定量限是1.0 ng/mL，RSD≤13.89%，RE為10.43%。

圖1　大鼠血漿中杠柳毒苷（1）和內(nèi)標(biāo)（2）的MRM圖Fig.1　Representative MRM chromatograms of Periplocin(1)and IS(2)in rats plasma

2.5.3精密度與準(zhǔn)確度精密量取空白血漿100μL，分別加入3種不同濃度的杠柳毒苷對(duì)照品溶液，使他們的終濃度為2、25、400 ng/mL，每個(gè)濃度溶液各6份，按照2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，連續(xù)測(cè)定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，得杠柳毒苷日內(nèi)、日間精密度RSD值分別小于13.94%和8.94%，準(zhǔn)確度在91.87%～101.36%之間。

2.5.4回收率及基質(zhì)效應(yīng)量取大鼠空白血漿100 μL，按2.4項(xiàng)下的處理方法，制備成濃度為2、25、400 ng/mL的低、中、高3種濃度血漿樣品各6 份，進(jìn)樣量為 5 μL，記錄下峰面積（A1）；另取空白血漿 100 μL，加入 40 μL 甲醇，按照 2.4 項(xiàng)下的方法處理后，用相應(yīng)低、中、高3個(gè)濃度的杠柳毒苷對(duì)照品復(fù)溶，進(jìn)樣量為 5 μL，記錄下峰面積（A2），則提取回收率為R=A1/A2×100%；同樣條件下進(jìn)相應(yīng)的低、中、高3個(gè)濃度杠柳毒苷對(duì)照品溶液，記錄下相應(yīng)峰面積（A0），則基質(zhì)效應(yīng)為M=A2/A0。3個(gè)濃度QC樣品的回收率分別為（86.20±0.06）%、（94.15±0.03）%和（90.23±0.04）%；內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素的提取回收率為（90.65±0.04）%。3個(gè)濃度QC樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為（90.54±0.06）%、（84.60±0.04）%和（93.86±0.03）%；內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素的基質(zhì)效應(yīng)為（91.49±0.09）%。

2.5.5穩(wěn)定性考察取大鼠空血漿100 μL，配成低、中、高 3種濃度（2、25、400 ng/mL）的 QC 樣品各3份，按照2.4項(xiàng)下的方法處理，分別考察其在室溫下6h再處理，血漿樣品處理后放置自動(dòng)進(jìn)樣器12h，反復(fù)凍融3次，血漿樣品-70℃冰箱中冷凍14 d穩(wěn)定性。杠柳毒苷準(zhǔn)確度在93.35%～113.13%之間，RSD值在1.79%～14.66%之間。結(jié)果表明杠柳毒苷在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.6藥動(dòng)學(xué)研究18只健康雄性SD大鼠，在最后1次給藥前禁食12 h，期間可自由飲水，分別在最后1 次給藥前以及給藥后 0.033、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 經(jīng)大鼠目?jī)?nèi)眥取血，置于肝素離心管中，6 000 r/min離心10 min，取上清后置于-70℃冰箱儲(chǔ)存，直至進(jìn)樣分析。3種給藥方式下杠柳毒苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，采用DAS 1.0軟件計(jì)算3組大鼠口服杠柳毒苷后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析比較各組間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異。

圖2　大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲線±s,n=6)Fig.2　Mean plasma concentration-time curve of Periplocin in rats after oral administration±s,n=6)

3　討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)原有的LC-MS/MS法進(jìn)行了優(yōu)化，該方法專屬性好，靈敏度高，線性范圍廣（1～500 ng/mL），線性關(guān)系良好（r=0.994 9），和原方法相比運(yùn)行時(shí)間短。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法符合生物樣品的測(cè)定要求，滿足大鼠血漿中杠柳毒苷的含量測(cè)定。

Jia等[10]采用靜脈注射和腹腔注射的給藥方式，利用LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿和組織中杠柳毒苷的含量，結(jié)果顯示杠柳毒苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為存在一定規(guī)律，各組織樣品中杠柳毒苷的含量均能被檢測(cè)到，但在大多數(shù)組織中，90%的杠柳毒苷在60 min后被降解；而本課題組[9]采用單次灌胃給藥方式，利用LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中杠柳毒苷及其代謝物杠柳次苷和杠柳苷元的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杠柳毒苷僅在大鼠給藥后很短的時(shí)間內(nèi)可被檢測(cè)到，無(wú)法擬合完整的藥時(shí)曲線。而本研究中，大鼠被連續(xù)灌胃給藥7 d后，檢測(cè)大鼠血漿中杠柳毒苷的含量，結(jié)果表明，給藥后各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品中的杠柳毒苷均能被檢測(cè)到；且與三七總皂苷配伍給藥后，杠柳毒苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為有明顯改變，主要表現(xiàn)為兩個(gè)配伍組與杠柳毒苷單獨(dú)給藥組的Cmax、AUC0-t和 AUC0-∞存在顯著性差異，杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組與杠柳毒苷單獨(dú)給藥組的Tmax值也存在顯著性差異；隨著配伍的三七比例增大，杠柳毒苷的T1/2、AUC0-t和AUC0-∞值呈遞減趨勢(shì)。上述結(jié)果說(shuō)明連續(xù)灌胃給藥可以使杠柳毒苷在大鼠體內(nèi)的代謝速度發(fā)生改變，三七總皂苷對(duì)杠柳毒苷的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程存在一定影響。

表1　不同組大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)±s)Tab.1　Pharmacokinetic parameters of Periplocin of rats in different groups±s)

表1　不同組大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)±s)Tab.1　Pharmacokinetic parameters of Periplocin of rats in different groups±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.05。

組別A組B組C組動(dòng)物數(shù)6　6　6 Cmax(ng/mL)　Tmax(h)　T1/2(h)　Ke(1/h)　AUC0-t(ng·h/mL)　AUC0-∞(ng·h/mL)260.79±141.53　0.063±0.027　5.26±3.28　0.19±0.13　988.21±469.16　1 593.61±815.18 23.98±　9.72*　0.183±0.092*　4.08±1.98　0.21±0.123　122.75± 74.71*　213.26± 96.05*29.21± 19.47*　0.283±0.209　1.91±1.13　0.461 7±0.265 2　119.45± 68.74*　168.38± 94.26*