扶腎方對尿毒癥大鼠腹膜間充質(zhì)TGF-β1、E-cadherin和α-SMA表達的影響*

雷洋洋，楊　波，裴　明，林　燕，楊洪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

腹膜纖維化作為長程腹膜透析常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致腹膜超濾與轉(zhuǎn)運功能衰竭，腹膜結(jié)構(gòu)、功能喪失。因此有必要探尋能夠干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)腹膜纖維化進程的分子機制，間充質(zhì)間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腹膜纖維化起始和可逆環(huán)節(jié)，有效調(diào)控EMT可抑制甚至逆轉(zhuǎn)早期腹膜纖維化，本課題擬采用天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科之扶腎方以中醫(yī)學(xué)“和法”理論為宗，探討扶腎方對尿毒癥大鼠腹膜間充質(zhì)EMT影響，為中醫(yī)治療腹透腹膜纖維化提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡6～8周，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2主要實驗試劑與儀器扶腎方中藥飲片（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）；肌酐生化試劑盒與尿素氮試劑盒（南京建成科技有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）（北京中杉金橋生物科技有限公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）；微量移液器（美國Eppendorf公司）；低溫高速離心機（美國Beckman公司）；-20℃/4℃冰箱（青島海爾）。

1.3分組與給藥50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組10只，每日給予扶腎方中藥灌胃，實驗周期為6周，具體見表1。

1.4尿毒癥模型鑒定50只雄性SD實驗大鼠在處死之前，目內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心15 min后，取上清，檢測血清肌酐值和血清尿素氮值。

1.5扶腎方含藥血清的制備方法采用清潔級雄性SD大鼠，按照人的臨床劑量折算大鼠的灌胃量，每組連續(xù)灌胃7 d，在最后1次灌胃后2 h，取血分離含藥血清，同時取正常組大鼠血，0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，56℃，30 min滅活補體，制成含藥血清冰箱保存?zhèn)溆茫?20℃含藥血清有效成分的濃度及有效成分由南開大學(xué)高分子化學(xué)研究所采用高效液相色譜法測定。

表1　實驗動物分組與給藥情況Tab.1　Grouping and administration of experimental animals

1.6檢測指標采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測 E-鈣黏素（E-cadherin）和 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），提取組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR的總反應(yīng)體系為20 uL，將樣品放入PCR儀，設(shè)定反應(yīng)參數(shù)后開始進行實驗數(shù)據(jù)的采集，引物序列見表2；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測TGF-β1含量的變化；采用堿性苦味酸比色法測定大鼠血清肌酐、尿素氮含量。

表2　E-cadherin、α-SMA基因引物Tab.2　E-cadherin、α-SMA primer

1.7光鏡下腹膜組織形態(tài)變化取大鼠壁層腹膜組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察大鼠腹膜形態(tài)改變。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)中的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1動物模型鑒定在尿毒癥模型復(fù)制過程中，若血清肌酐和尿素氮較正常組明顯升高，則視為尿毒癥模型成功。本實驗檢測血清肌酐和尿素氮，實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組血清肌酐、尿素氮均明顯升高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01或P＜0.05），符合尿毒癥模型的特征；而與模型組相比，扶腎方中、高劑量組肌酐及尿素氮的含量有降低的趨勢，且高劑量組的降低趨勢更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明不同劑量的扶腎方均有降低血清肌酐和血清尿素氮的作用。見表3。

表3　血清肌酐與血清尿素氮含量（x±s）Tab.3　Serum creatinine and serum urea nitrogen（x±s）

2.2大鼠腹膜形態(tài)學(xué)改變HE染色結(jié)果顯示，正常組的大鼠壁層腹膜組織結(jié)構(gòu)相對完整，間皮下基質(zhì)較薄。與正常組相比，模型組有腹膜間皮細胞的變性、脫落，間皮下基質(zhì)明顯增厚，炎癥細胞浸潤以及血管增生。治療組相對模型組，腹膜間皮細胞相對連續(xù)，炎癥細胞浸潤和血管新生現(xiàn)象明顯減少，尤高劑量組的效果最為明顯。見圖1。

2.3TGF-β1、E-cadherin和α-SMA的水平結(jié)果顯示，模型組E-cadherin較正常組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），TGF-β1、α-SMA 較正常組表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，扶腎方干預(yù)后的各組E-cadherin表達均有所上調(diào)，且以高劑量組上調(diào)最為明顯（P＜0.01）；TGF-β1、α-SMA中、高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），低劑量組較正常組有下調(diào)趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

3　討論

據(jù)中國慢性腎臟病流行病學(xué)調(diào)查，中國有1.2億慢性腎臟病人口和不少于100萬的尿毒癥患者群體[1]。腹膜透析（PD）作為一種對終末期腎臟病（ESRD）的有效治療方式[2]，具有利于殘余腎功能保護，中分子溶質(zhì)清除較好，早期生存率、生活質(zhì)量更優(yōu)，患者疾病負擔小，可以更大程度回歸社會等優(yōu)勢，已在國家醫(yī)療衛(wèi)生層面和人民健康的戰(zhàn)略層面占據(jù)越來越重要的地位。據(jù)中國研究數(shù)據(jù)服務(wù)（CNRDS）數(shù)據(jù)，截止2013年底中國有腹膜透析患者 4.6萬人；而在全球范圍，腹膜透析患者已超25萬人。由于臨床最常用的腹膜透析液以葡萄糖為滲透劑，使得腹膜間皮細胞長期浸潤在腹透液中，而腹透液屬于生理不相容溶液，容易發(fā)生上皮EMT，導(dǎo)致腹膜纖維化，使得腹膜失去超濾能力，發(fā)生超濾衰竭。

圖1　大鼠腹膜HE染色結(jié)果（×200）Fig.1　HE staining of rat peritoneum（×200）

表 4　TGF-β1、E-cadherin 和 α-SMA 的水平（x±s）Tab.4　Levels of TGF-β1,E-cadherin and α-SMA（x±s）

腹膜纖維化以細胞外基質(zhì)過度沉積、組織結(jié)構(gòu)重塑為主要特征，是導(dǎo)致臟器功能喪失的主要原因之一[3]。目前纖維化疾病的發(fā)生及發(fā)展機制尚不明確，有研究提示炎癥反應(yīng)的激活、某些促纖維化因子的活化包含在纖維化的過程當中[4-5]，部分分子信號通路已被證實參與腹膜纖維化的形成，包括TGFβ介導(dǎo)的信號通路，如Smad通路、PI3k/AKT/mTOR通路、MEK/ERK/NKκB通路、受體酪氨酸激酶（RTKs）介導(dǎo)的信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路和Notch信號通路等[6-7]。

EMT被認為發(fā)生于腹膜纖維化的早期階段并在腹膜纖維化中起到了關(guān)鍵性的作用[8]。EMT以細胞間連接丟失（E-cadherin表達下調(diào)）、細胞骨架重塑（α-SMA表達上調(diào)），從而導(dǎo)致細胞極性丟失及梭形結(jié)構(gòu)的形成為特征。而作為長程PD患者的常見并發(fā)癥，腹膜纖維化可導(dǎo)致維持性PD患者出現(xiàn)腹膜超濾與轉(zhuǎn)運功能衰竭，腹膜結(jié)構(gòu)和功能喪失，最終掉隊退出治療[9]。

隨著透析時間增長，腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的機制仍未完全明了，研究表明在纖維化早期有可能阻止甚至逆轉(zhuǎn)其病變，但具體都經(jīng)由何機制得以逆轉(zhuǎn)亦不確切可知。故而在此背景下，探尋能夠有效干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)長程PD基礎(chǔ)上腹膜纖維化進程的分子機制即成為當前亟待解決的重要臨床與科研現(xiàn)實問題。

研究發(fā)現(xiàn)[9]，上皮-EMT是早期腹膜損傷的關(guān)鍵一步，這個過程表現(xiàn)為細胞間連接受損、骨架重排以及基底膜降解，進而細胞呈現(xiàn)游走性和侵襲性的特征，此時，細胞間黏附連接蛋白E-cadherin表達進行性下降，α-SMA作為一種細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的標記蛋白表達增強[10-11]，能夠促進上皮細胞EMT的發(fā)生，同時還能增加細胞外基質(zhì)的合成，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致其過度沉積，是引起腹膜纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。本實驗在SD大鼠尿毒癥模型的基礎(chǔ)上制備腹膜纖維化的模型，此模型貼近臨床實際。通過檢測動物模型的肌酐及尿素氮指標，其值明顯升高，HE染色見腹膜間皮細胞的變性、脫落，間皮下基質(zhì)增厚，炎癥細胞浸潤以及血管增生，腹膜轉(zhuǎn)分化的相關(guān)指標E-cadherin表達下調(diào)，α-SMA表達呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢，符合腹膜纖維化特征。而在給予不同劑量的扶腎方用藥干預(yù)后，炎癥細胞浸潤以及血管增生現(xiàn)象較模型組明顯減少，E-cadherin表達上調(diào)，α-SMA表達呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢，研究結(jié)果提示腹膜EMT與E-cadherin和α-SMA的表達密切相關(guān)。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）生長因子家族成員之一，分布在多種細胞內(nèi)，在腎臟表達量最高，活性最強，是一種多向性，多效性的細胞因子，通過細胞表面的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細胞生長周期、增殖分化、細胞外基質(zhì)的形成以及免疫等功能[12-13]，是一種有助于調(diào)節(jié)腹膜纖維化的促細胞因子[14]，能夠促進上皮細胞EMT的發(fā)生，同時還能通過增加細胞外基質(zhì)的合成并減少細胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致其過度沉積，最終導(dǎo)致相關(guān)組織的纖維化。長期腹膜透析的患者AGEs在腹膜周圍存在大量蓄積，并伴有TGF-β1的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生[15]。

本實驗TGF-β1的檢測結(jié)果中，經(jīng)扶腎方干預(yù)后，TGF-β1的表達出現(xiàn)下調(diào)趨勢，提示扶腎方通過抑制受體復(fù)合物的形成而抑制腹膜纖維化。

中醫(yī)理論認為，慢性腎臟病的病變根本是腎氣虧虛，病機關(guān)鍵在于腎臟主水封藏功能和失職所致。其中陰陽失調(diào)是核心，“陰平陽秘，精神乃治”，是腎臟乃至全身臟器免受病變侵害的關(guān)鍵。正如《素問·生氣通天論》所謂“陰平陽秘”，即人體陰陽動態(tài)平衡協(xié)調(diào)是健康的根本。腹膜透析系慢性腎功能衰竭終末期的替代治療手段，此時患者病程遷延，多呈脾腎虧虛，正氣不足之象，同時久病血瘀，經(jīng)絡(luò)澀滯，水濕不運，濁毒化生，日久瘀濁互結(jié)，癥瘕內(nèi)見，而呈邪實留戀之勢。因此，該階段臨床遣方用藥尤須慎重精當，以免偏頗叢生，影響疾病向愈。因此治療中應(yīng)在調(diào)補陰陽的基礎(chǔ)上，重視和解少陽，調(diào)和氣血，即運用“和法”，和緩地調(diào)整機體的陰陽失調(diào)、升降失常、氣血失和。

和法是中醫(yī)傳統(tǒng)治療八法之一,是利用藥物的疏通調(diào)和作用,以達解除病邪,或調(diào)和臟腑、陰陽、表里失調(diào)之證得以解除,屬于調(diào)整人體機能的一種方法[16]。扶腎方以中醫(yī)學(xué)“和法”理論為宗，以療效確切的經(jīng)方對藥為基礎(chǔ)，融“和”、“補”、“消”為一體[17]，組方合理精當,選藥簡約質(zhì)樸。其以和法為總則，用藥和緩，平調(diào)陰陽；補瀉兼施，扶正祛邪，性質(zhì)平和，統(tǒng)籌兼顧。方用陳皮、半夏、黃芪、當歸、仙靈脾、丹參、大黃、鬼箭羽等組方。既往研究證實扶腎顆粒可有效延緩腹膜纖維化進程，進而提高透析效能，改善患者生存質(zhì)量[18-19]。

綜上所述，本課題研究結(jié)果顯示，扶腎方各組與模型組對比，抑制TGF-β1表達，促進E-cadherin表達，其表達進行性上調(diào)，同時抑制α-SMA表達，進行性下調(diào)α-SMA表達，且隨著扶腎方劑量的加大，其作用更加明顯，說明扶腎方在腹膜組織纖維化EMT過程中起著一定作用。為臨床上進一步運用中醫(yī)藥減輕腹膜損傷，延緩腹膜纖維化提供了理論支持，也為提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期提供了可能。