黃芩苷納米混懸劑大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究*

盧　鵬，MAIKHONE VILAKHAMXAY，任　靜，邢　月，王舒雅，薛志峰，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津　300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津　300193）

黃芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）來源于唇形科植物黃芩的干燥根[1]。黃芩含有黃酮類、酚酸類、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等成分[2]，其中黃酮是其主要的有效成分。目前從黃芩屬藥材中已發(fā)現(xiàn)40多種黃酮類成分[3-4]，主要有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素苷、千層紙素等[5]。黃芩苷的含量是黃芩藥材及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)，也是給藥后體內(nèi)藥物的重要檢測指標(biāo)?，F(xiàn)代研究表明，黃芩苷具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝和抗動脈粥樣硬化等藥理作用[6-7]，但黃芩苷不溶于水且脂溶性較差，導(dǎo)致其口服生物利用度低，限制了其藥效的發(fā)揮及臨床應(yīng)用。目前，已有通過脂質(zhì)體、磷脂復(fù)合物、包合物、聚合物膠束、滴丸及固體分散等制劑技術(shù)提高黃芩苷生物利用度的研究[8-9]，但這些技術(shù)仍存在成本較高、載藥量低等問題。有研究發(fā)現(xiàn)，納米混懸劑能增加藥物的溶出度與穩(wěn)定性，進而提高藥物的生物利用度和藥效等。本實驗建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的方法測定大鼠血漿中黃芩苷的血藥濃度，對大鼠灌胃給予黃苓（BLNSPS）后黃芩苷的藥代動力學(xué)進行了研究。

1　材料

AH100D高壓均質(zhì)機（奧地利，ATS公司）；FA25高剪切分散乳化機（德國，F(xiàn)LUKO公司），液質(zhì)聯(lián)用儀（美國，Agilent公司，包括1290型高效液相色譜儀、6460型三重四級桿質(zhì)譜儀、MassHunter工作站）；XW-80A型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；XP205型十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；ST16R型通用臺式離心機（美國，Thermo公司）。黃芩苷原料藥（天津中新藥業(yè)研究中心，純度 85.0%）；泊洛沙姆-188（Poloxamer，德國，巴斯夫公司）；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201318，含量以93.3%計）；卡馬西平（中國食品藥品檢定研究院，批號100142-201105，含量以99.7%計）；肝素鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號 325D024，效價≥140單位/mg）；甲酸為色譜純（購自東京化成工業(yè)株式會社），甲醇、乙腈均為色譜純（購自Fisher Scientific公司）。

SD 大鼠，雄性，180～220 g，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（軍）2014-004。大鼠隨機分成2組，每組6只，分別為黃芩苷原料藥（BL-Bulk）組、BL-NSPS組。

2　方法

2.1BL-NSPS的制備采用高壓均質(zhì)法制備黃芩苷納米混懸劑。分別稱取黃芩苷原料藥0.5 g，Poloxamer-188 0.2 g，加入蒸餾水50 mL，使用高剪切分散乳化機進行5次攪拌，每次600 r/min，2 min，直至完全溶解，然后在1 200 bar壓力下高壓乳勻15個循環(huán)，得到BL-NSPS。

2.2樣品測定色譜條件及質(zhì)譜條件

2.2.1色譜條件色譜柱：WatersACQUITYUPLC?HSS C18柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm，美國 Waters公司）；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min；進樣量：5 μL；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～4 min，5%～32%B；4～4.1 min，32%～20%B；4.1～4.5 min，20%～30%B；4.5～9 min，30%～50%B；9～9.1 min，50%～5%B；9.1～10 min，5%～5%B）。

2.2.2質(zhì)譜條件離子源：采用電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；干燥氣：氮氣；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：15 psi；毛細管電壓：3 500 V，具體參數(shù)見表1。

表1　黃芩苷的主要質(zhì)譜參數(shù)Tab.1　The main mass spectrometric parameters of baicalin

2.3血漿樣品處理方法與測定取100 μL血漿加入200μL內(nèi)標(biāo)溶液（卡馬西平40ng/mL），渦旋3min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進LC-MS/MS分析。

2.4專屬性考察取空白血漿、空白血漿加對照品（黃芩苷1 250 ng/mL）、給藥后血漿樣品，按2.3項下方法處理，在2.2項條件下進樣測定，記錄質(zhì)譜圖。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取對照品溶液100 μL，氮氣吹干，加入空白血漿100μL，使黃芩苷濃度為4950、2 475、1 237.5、618.75、309.375、123.75、24.75 ng/mL，按照2.3項下方法處理后進樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以黃芩苷濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，黃芩苷與卡馬西平的峰面積比值為縱坐標(biāo)，加權(quán)（W=1/x）法進行回歸運算，求得黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)取對照品溶液100μL，氮氣吹干，按2.3項下的方法分別制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6），在2.2項條件下進樣測定，所得樣品濃度與取空白血漿，按2.3項下的方法處理，后加入對照品溶液，制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6）濃度相比，測定提取回收率。取對照品溶液100 μL，氮氣吹干，按2.3項下的方法分別制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6），在2.2項條件下進樣測定，所得樣品濃度與取對照品溶液100、200 μL甲醇，分別制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6）濃度相比，測定基質(zhì)效應(yīng)。

2.7精密度及準(zhǔn)確度取空白血漿100μL，按2.3項下的方法分別制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6），分別在同日內(nèi)和連續(xù)3 d用同1條標(biāo)準(zhǔn)曲線進行處理、分析，得到日內(nèi)精密度RSD、日間精密度RSD和準(zhǔn)確度RE。

2.8穩(wěn)定性取空白血漿100 μL，按2.3項下的方法分別制備低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（n=6），考察樣品4℃放置24 h、室溫下放置8 h、-20℃反復(fù)凍融3次、-20℃凍融30 d。

2.9給藥及血樣采集成年雄性SD大鼠12只，飼養(yǎng)1周后，隨機分成2組，每組6只，實驗前禁食12h，自由飲水。取大鼠稱質(zhì)量并編號，第1組按50 mg/kg的劑量灌胃給予黃芩苷原料藥溶液；第2組按50mg/kg的劑量灌胃給予BL-NSPS。分別在大鼠給藥后的0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h時，經(jīng)眼瞼靜脈叢取血0.3 mL，置1.5 mL的離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿置另一1.5mL離心管中，置冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.10數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0和WinNonlin 6.0版藥動學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學(xué)分析采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1專屬性本研究方法分離效果好，專屬性強，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線黃芩苷在血漿濃度24.75～4 950.00 ng/mL，線性關(guān)系良好。回歸方程為Y?=0.000 971 979 6X ＋ 0.016 489，r=0.997 4（n=7）。

3.3提起回收率與基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示該方法的提取回收率均在（82.0±4.95）%～（97.0±3.82）%之間，RSD＜10%符合生物樣品測定要求，同時結(jié)果顯示不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。

表2　黃芩苷的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)Tab.2　Extraction recovery and matrix effect of baicalin%

3.4精密度及準(zhǔn)確度黃芩苷日內(nèi)精密度RSD＜5%、日間精密度RSD＜5%，準(zhǔn)確度偏差RE值均在±5%以內(nèi)，均符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定，結(jié)果見表3。

表3　方法的精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果Tab.3　Precision and accuracy of analysis for baicalin

3.5穩(wěn)定性黃芩苷穩(wěn)定性RE值均在±5%以內(nèi)，表明黃芩苷在上述條件下可保持穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4　不同儲存條件下的穩(wěn)定性Tab.4　Stabilities of baicalin under different storage conditionsin

3.6BL-NSPS大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)大鼠血漿中黃芩苷的血藥濃度-時間曲線見圖1，經(jīng)WinNonlin 6.0版藥動學(xué)軟件計算得到的藥物動力學(xué)參數(shù)見表5。由圖1和表5可知，大鼠灌胃給藥后，BL-Bulk在8.4 min 達到峰濃度（1 257.84±158.21）ng/mL，0～24 h的藥時曲線下面積為（8 373.63±1 995.98）ng·h/mL。與BL-Bulk相比，BL-NSPS的達峰時間未發(fā)生變化，峰濃度和0～24 h的藥時曲線下面積分別為（3329.10±499.10）ng/mL、（13479.37±4001.18）ng·h/mL。BL-NSPS的達峰血藥濃度和藥-時曲線下面積較BL-Bulk有了顯著提高，即BL-NSPS提高了黃芩苷的體內(nèi)生物利用度。

圖1　大鼠分別灌胃給藥BL-Bulk和BL-NSPS后黃芩苷血漿藥物濃度-時間曲線(n=6)Fig.1　Concentration-time curve of baicalin in plasma of rats after intragastric administration of BL-Bulk and BLNSPS(n=6)

4　討論

目前，檢測黃芩苷的方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、阻抑-催化褪色光度法等。其中高效液相色譜或LC-MS/MS準(zhǔn)確度高、靈敏度高，也是黃芩苷的藥代動力學(xué)研究中血漿藥物濃度法最常用的分析手段[10-11]。本實驗對血漿樣品中黃芩苷的提取方法進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，重現(xiàn)性好，可達實驗測定要求。實驗所建立的流動相梯度洗脫程序能有效地將黃芩苷和內(nèi)源性成分分離。本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給藥后，血漿中黃芩苷的藥時曲線出現(xiàn)雙峰，說明黃芩苷在大鼠體內(nèi)存在肝腸循環(huán)。大鼠藥代動力學(xué)實驗結(jié)果顯示，BL-NSPS的達峰濃度較BL-Bulk也有了顯著提高，說明納米混懸劑增加了藥物的吸收速率，可能是因為BL-NSPS的溶出速率有了較大提高。BL-NSPS的相對生物利用度為（160.97±47.78）%，與 BL-Bulk相比，BL-NSPS吸收有所提高，可能是由于納米混懸劑藥物粒徑小，比表面積大，溶解度高，對黏膜的黏附性強，增加藥物在胃腸道中的吸收，提高藥物的生物利用度。由此證明，納米級藥物在很大程度能夠提高藥物的溶解度與溶出速度，進而促進藥物吸收并提高藥效。

表5　大鼠分別灌胃給藥黃芩苷原料藥和納米混懸劑后黃芩苷的主要藥動學(xué)參數(shù)(x±s)Tab.5　Pharmacokinetic parameters of baicalin in plasma of rats after intragastric administration of BL-Bulk and BL-NSPS±s)

表5　大鼠分別灌胃給藥黃芩苷原料藥和納米混懸劑后黃芩苷的主要藥動學(xué)參數(shù)(x±s)Tab.5　Pharmacokinetic parameters of baicalin in plasma of rats after intragastric administration of BL-Bulk and BL-NSPS±s)

注：2組的達峰時間均為（0.14±0.09）h;BL-NSPS的Cmax與BC-Bulk組比較，P＜0.05。

參數(shù)BL-Bulk BL-NSPS n　6　6 Cmax（h）Tmax（ng/mL）AUC0-t（ng·h/mL）Lz（1/h）T1/2（h）Vz/F（mL/kg）Cl/F[mL/（h·kg）]MRT（h）1 257.84±158.21　0.14±0.09　8 373.63±1 995.98　0.11±0.03　6.80±2.23　1 094 739.19±715 848.25 104 015.47±54 404.18 18.09±9.04 3 329.10±499.10　0.14±0.09　13 479.37±4 001.18　0.11±0.02　6.35±1.03　315 659.67±100 402.58　35 542.22±14 517.71　10.54±8.50