TRPM7通道激酶研究進展

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(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078；2.中南大學湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科)

瞬時受體電位(Transient Receptor Potential，TRP)通道最初是在TRP基因突變或缺陷的果蠅感光細胞中發(fā)現(xiàn)的；目前已發(fā)現(xiàn)29種TRP通道成員，分為TRPC(TRPC1-7)、TRPV(TRPV1-6)、TRPM(TRPM1-8)、TRPML(TRPML1-3)、TRPP(TRPP2/3/5)、TRPA(TRPA1)、TRPN七大家族[1]。TRPM家族中的TRPM7于2001年由D. Clapham、A. Scharenberg及A. Ryazanov實驗室分別獨立克隆，由于其獨特的雙重蛋白結(jié)構(gòu)，最初也被命名為TRP-PLIK，CHAK1，LTRPC7[2]；近年來，TRPM7已成為最具代表性、研究最廣泛的雙功能膜蛋白。

1　TRPM7的表達與結(jié)構(gòu)特點

在人類基因組中，TRPM7基因位于第15號染色體上，由39個外顯子組成，共編碼1865個氨基酸。TRPM7在哺乳動物各器官中廣泛分布，是成年小鼠各器官中表達量最高的TRP通道，如在腦、心臟、腎、肺、腸和睪丸等器官中均有較高表達。與其他TRP通道成員相比，TRPM7在背根神經(jīng)節(jié)中的表達最為豐富[3]。在小鼠胚胎發(fā)育的不同時期，TRPM7的表達水平也表現(xiàn)出明顯差異：其在胚胎發(fā)育18天達到最高峰，在出生后第四天可再次出現(xiàn)表達高峰，此后可維持其表達水平直至小鼠成年。

TRPM7通道是一種跨細胞膜的、以異源四聚體形式存在的通道蛋白，在細胞膜上是一段六次跨膜結(jié)構(gòu)(S1-S6)，S5與S6之間形成通道孔徑；位于通道孔徑中的E1047或Y1049可影響通道對Ca2+的敏感性[4]。其N端與C端均位于細胞膜內(nèi)，N端主要為四個TRPM家族的同源結(jié)構(gòu)域(Melastatin Homology Domain,MHD)，C端結(jié)構(gòu)依次為：TRP box，雙螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain，CC)以及蛋白激酶區(qū)。TRP box是一個高度保守并富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，大約由25個氨基酸殘基組成，可與PIP2相互作用，共同調(diào)節(jié)TRP通道的功能[1]；CC結(jié)構(gòu)域除可介導TRPM7亞基形成異源四聚體外，還可影響其通道部分對Mg·NTP復合物的敏感性[5]；C末端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域?qū)儆诜堑湫挺?激酶結(jié)構(gòu)，除可將其自身及底物磷酸化外，也可被活化的caspase切割，并在不影響自身磷酸化活性的情況下增強離子通道功能[6]。TRPM7激酶結(jié)構(gòu)域由1580～1863位氨基酸殘基組成[7]，其中1781～1799氨基酸序列內(nèi)包含一個保守的ATP結(jié)合基序；H1751、H1808、C1804和C1810可與Zn2+絡(luò)合形成一個Zn2+結(jié)合模序，對維持激酶穩(wěn)定性有著重要作用；K1646、D1765、Q1767和D1775則為激酶活性所必需。此外，1553～1562氨基酸殘基構(gòu)成絲氨酸/脯氨酸的富集片段，1563～1670氨基酸殘基構(gòu)成二聚化區(qū)域(圖1為TRPM7亞基的基本結(jié)構(gòu))。

圖1　TRPM7亞基的基本結(jié)構(gòu)

2　TRPM7通道的離子通透性及蛋白激酶活性

2.1離子通透特性TRPM7對單價(如K+、Na+等)和二價金屬陽離子(如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Ni2+等)均有通透性，但對陰離子不通透。對二價陽離子的通透能力依次為：Zn2+≈Ni2+>>Ba2+>Co2+>Mg2+≥Mn2+≥Sr2+≥Cd2+≥Ca2+。其離子通透性可被分子量相對較大且結(jié)構(gòu)復雜的多胺類所抑制[8]。研究表明，位于TRPM7通道孔徑內(nèi)的部分氨基酸殘基可控制其對Ca2+和Mg2+的通透性，例如將Glu-1047或Glu-1052突變成Gln，可分別降低甚至消除其對Ca2+、Mg2+的通透性[9]；此外，D1054和D1059也可影響二價陽離子的通透性[8]。膜片鉗技術(shù)記錄的TRPM7通道電流具有以下4個特點[8]：(1)電流具有明顯外向整流特性；(2)通道的失活或激活均無時間或電壓依賴性；(3)電流可被細胞內(nèi)高濃度的Mg2+抑制，但這種抑制不影響其整流特性；(4)其通道電導可達到40pS，且開放時間較長，一般可達幾百毫秒。

2.2蛋白激酶活性TRPM7的激酶結(jié)構(gòu)域?qū)儆讦良っ讣易?，在序列上除了其催化結(jié)構(gòu)域以外，幾乎與經(jīng)典的真核蛋白激酶序列無同源性。TRPM7激酶以鎂離子依賴的形式特異性磷酸化絲氨酸與蘇氨酸，其磷酸化底物主要有髓磷脂堿性蛋白(MBP)、組蛋白以及其自身等。S1511和S1567是目前已確認的兩個自我磷酸化位點，二者的突變可影響激酶活性，但不影響其通道功能[10]。Ryazanova等人發(fā)現(xiàn)[10]，Mn2+和Mg2+可顯著增強TRPM7激酶活性；相反的，Zn2+和Co2+卻可明顯抑制其激酶活性，而Ca2+則對激酶活性無影響。但是體內(nèi)實驗表明，在所有TRM7可通透的二價陽離子中，只有Mg2+可直接調(diào)節(jié)激酶活性。目前僅發(fā)現(xiàn)TRPM6通道與TRPM7有著相似的雙重蛋白結(jié)構(gòu)，而且TRPM6激酶可磷酸化TRPM7激酶結(jié)構(gòu)域，進而調(diào)控TRPM7/TRPM6通道復合物的功能[11-12]。此外，TRPM7激酶結(jié)構(gòu)域翻譯后還可被剪切并轉(zhuǎn)位至細胞核中，通過與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)相互作用或者磷酸化組蛋白H3等，進而發(fā)揮表觀調(diào)節(jié)因子作用[13]。與TRPM7通道功能的調(diào)節(jié)機制相比，目前對其激酶結(jié)構(gòu)域的作用仍知之甚少，還有待進一步深入研究。

3　通道功能的調(diào)控機制

3.1鎂離子TRPM7的離子通道功能和激酶活性都依賴于細胞內(nèi)二價陽離子濃度，但當細胞內(nèi)二價陽離子(如Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+等)濃度過高時，其通道功能也可受到明顯抑制[8]。研究表明，Mg2+是影響TRPM7通道功能的二價陽離子中最重要的抑制因素，主要通過減少激活形式的通道數(shù)量來減少單通道電導。Chokshi等用單通道膜片鉗技術(shù)記錄Jurkat T細胞內(nèi)源性TRPM7電流發(fā)現(xiàn)，其可產(chǎn)生39pS和186pS兩個電導峰，但當細胞內(nèi)鎂離子濃度升高時，其電流可明顯受到抑制；Mg2+的這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性，其IC50值分別為25μM和91μM。全細胞膜片鉗實驗表明，無論是在過表達體系還是內(nèi)源性表達體系中，抑制50%的通道活性均需要750μM以上的[Mg2+]i；但單通道膜片鉗實驗檢測到的Mg2+抑制效能比全細胞膜片鉗實驗中檢測到的要小10到20倍，說明細胞中很可能還存在其他調(diào)節(jié)因子可影響TRPM7通道對Mg2+的敏感性。由于TRPM7獨特的蛋白結(jié)構(gòu)，其激酶結(jié)構(gòu)與離子通道結(jié)構(gòu)之間存在何種關(guān)系成為該領(lǐng)域的一個熱門問題。2003年，Schmitz等人將位于激酶結(jié)構(gòu)域的Mg·NTP結(jié)合位點進行單點突變(G1799D，K1648R)，發(fā)現(xiàn)突變不僅影響TRPM7的磷酸化活性，而且可明顯降低通道對[Mg2+]i的敏感性。但通道功能的改變并非是由于磷酸化活性的改變所引起，Matsushita等人在2005年證明了這一點[10]：他們將S1511/S1567進行單點突變，發(fā)現(xiàn)突變型與野生型的通道功能并無差異。隨后科學家們陸續(xù)證明細胞內(nèi)Mg2+可通過與TRPM7抑制劑waixenicin A、胞內(nèi)氯化物和Mg·NTP等因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)TRPM7通道功能。

3.2Mg·NTP細胞內(nèi)鎂離子水平對TRPM7通道功能的調(diào)節(jié)作用是被公認的。在生理狀態(tài)下細胞內(nèi)游離Mg2+可與ATP形成Mg·ATP復合物，該復合物與激酶結(jié)構(gòu)域中的核苷酸結(jié)合位點(K1648)相結(jié)合，進而發(fā)揮其抑制作用[14]。幾乎所有Mg·NTP復合物都可不同程度地抑制TRPM7的通道活性：ATP>TTP>CTP≥GTP≥UTP>ITP。此外，Mg·ADP也有相似的抑制作用，但Mg·AMP卻沒有，提示在細胞能量水平變化時，TRPM7通道的激活將受到限制。在1599位氨基酸殘基處截斷激酶結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TRPM7將完全喪失其通道功能[10]；而在1569位氨基酸殘基處截斷激酶結(jié)構(gòu)時，其部分通道功能將得到恢復[14]；若進一步在1510位截斷，其通道功能便可完全恢復[6]。由此可推測，1510～1599氨基酸序列中可能包含Mg2+的結(jié)合位點。此外，TRPM7與TRPM6之間的相互作用可增加Mg2+及其復合物對通道抑制作用的閾值[15]。

3.3受體門控性調(diào)節(jié)近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)通路是調(diào)節(jié)TRPM7通道活性的另一重要因素。Macianskiene R等在心肌細胞中過表達TRPM7，發(fā)現(xiàn)Gαq受體、酪氨酸激酶受體或者GTP類似物(GTP-γ-S)都可以通過激活PLC水解PIP2，最終導致TRPM7通道失活。對大鼠海馬神經(jīng)元細胞的研究也表明，神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)可以通過激活PLC來減少TRPM7的外向電流[16]。但是，PIP2耗竭對TRPM7門控的影響存在一定的爭議，主要取決于實驗方法以及PIP2消耗與再合成的速率。Langeslag等認為PLC對TRPM7通道功能的調(diào)節(jié)與細胞內(nèi)Mg2+濃度有關(guān)；當細胞內(nèi)Mg2+濃度維持在正常生理濃度時，G蛋白偶聯(lián)受體、緩激肽等激活PLC后可激活TRPM7通道，而并非抑制其活性。而Takezawa等則認為TRPM7通道活性的調(diào)節(jié)與其自身激酶結(jié)構(gòu)域以及蛋白激酶A(PKA)有關(guān)，而非PLC通路。

4　TRPM7通道與疾病的研究

研究表明，TRPM7可參與細胞內(nèi)鈣/鎂平衡的調(diào)節(jié)，以及細胞增殖、遷移、黏附等過程，TRPM7功能缺陷對局部腦缺血、心血管疾病、癌癥等疾病也存在一定的潛在影響。

4.1TRPM7與缺血性腦卒中缺血性中風是世界上殘疾和死亡的主要原因之一。研究表明，離子穩(wěn)態(tài)的破壞在腦缺血后的細胞死亡中起重要作用。谷氨酸受體途徑(NMDA)介導的離子失衡和神經(jīng)毒性可導致腦卒中后腦缺血。近年來，也發(fā)現(xiàn)TRPM7可通過非NMDA途徑參與缺血性腦卒中的發(fā)病機制。在局部腦缺血損傷時，細胞外Ca2+內(nèi)流以及pH降低均可反饋性地激活TRPM7通道，造成細胞內(nèi)鈣超載以及氧自由基水平升高，從而參與神經(jīng)元死亡過程[17]。TRPM7過度激活使Zn2+等毒性陽離子內(nèi)流增加也是導致腦卒中的另一原因。此外，TRPM7介導的鈣離子內(nèi)流可調(diào)控eNOS活性并促進NO生成，最終導致衰老時腦血管炎癥[18]。Tseveleki V等將TRPM7與腦相關(guān)疾病(如阿爾茲海默癥，多發(fā)性硬化癥和腦中風等)進行流行病學統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在這些小鼠疾病模型中有18種常見基因受到異常調(diào)控，而TRPM7正是其中之一。

4.2TRPM7與心血管疾病TRPM7在心血管疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。早年有學者發(fā)現(xiàn)在豬、大鼠和人的心肌細胞均存在TRPM7樣電流。2010年，Du J等對心房顫動患者進行研究發(fā)現(xiàn)，在患者心肌成纖維細胞中，TRPM7介導的Ca2+電流明顯增加，進而誘導轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)表達上調(diào)，并增加成纖維細胞的分化與纖維化，這也是導致患者心房纖顫的主要原因。血管鈣化是慢性腎病患者存在的一個普遍現(xiàn)象，而礦物質(zhì)代謝紊亂是促成血管鈣化主要因素，尤其是細胞內(nèi)高磷水平。TRPM7在平滑肌細胞中對維持Mg2+穩(wěn)態(tài)以及血管平滑肌細胞生長和分化起到重要作用[19]。研究表明[20]，在主動脈平滑肌細胞中Mg2+過高也可導致主動脈鈣化。而在用TRPM7抑制劑2-APB或siRNA特異性干擾后，可逆轉(zhuǎn)血管鈣化現(xiàn)象，提示TRPM7可通過介導細胞內(nèi)Mg2+濃度升高進而參與血管鈣化。

4.3TRPM7與癌癥TRPM7參與多種癌細胞生長、增殖、分化與遷移等過程，例如，減少TRPM7的表達可抑制膀胱癌、前列腺癌等癌細胞的增殖與侵襲等，因此TRPM7也被列為癌癥治療的靶點之一。此外，由于TRPM7對Ca2+和Mg2+具有獨特通透性，也使得其與癌癥之間的聯(lián)系更加密切。例如，TRPM7的多態(tài)性點突變T1482I可加重遺傳性肌萎縮和麻痹癡呆癥狀，而當Ca2+∶Mg2+攝取比例增高時，其患病風險也將進一步增加[20]。

TRPM7不僅結(jié)構(gòu)獨特，而且其活性在細胞生命活動過程中也具有重要地位，是促進器官生成與維持組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在過去十年中，學者們已花費大量精力來闡述TRPM7及其下游的調(diào)控機制，證實了TRPM7是維持細胞與其組織微環(huán)境之間的聯(lián)系所必需。對TRPM7表達與功能的深入研究將有助于理解一些重大疾病如癌癥、缺血性中風和心血管疾病等的病理過程。使用TRPM7通道和激酶突變體以及選擇性抑制通道或激酶的藥理學工具進行系統(tǒng)研究，也將為評估其治療價值提供重要的研究手段。此外，目前對其自身在轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平上的調(diào)控機制尚未完全清楚，是否存在其他mRNA或蛋白亞型以及其作用也仍需進一步研究。因此，我們希望對TRPM7基礎(chǔ)作用機制以及臨床轉(zhuǎn)化的研究能夠為這些疾病提供新的治療方法。