不同品種烤煙衰老期碳氮代謝及相關(guān)基因表達的差異分析

張小全，蔡文龍，闞洪贏，薛冰潔，賈振宇，王帥，武云杰

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63號 450002

煙草以收獲葉片為目的，煙葉成熟的過程就是逐漸衰老的過程，也是煙葉品質(zhì)形成最關(guān)鍵的時期[1-2]。煙葉的碳氮代謝是煙葉最基礎(chǔ)的物質(zhì)代謝，與施氮量、品種等因素密切相關(guān)[3-4]。碳代謝包括無機碳的光合固定代謝、單糖的轉(zhuǎn)化以及淀粉的積累等過程[5]。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS）參與直鏈淀粉的合成[6]，淀粉分支酶（SBE）是合成支鏈淀粉的關(guān)鍵酶[7]，兩個關(guān)鍵酶的活性，是反應(yīng)碳代謝強度的重要指標。氮代謝包括氮素的吸收、同化、轉(zhuǎn)運、利用、調(diào)節(jié)等過程[5]。硝酸還原酶（NR）和谷氨酸脫氫酶（GDH）分別在氮素的吸收和轉(zhuǎn)運方面具有重要作用[8-9]，谷氨酰胺合成酶（GS）是控制銨離子轉(zhuǎn)移和再同化的關(guān)鍵酶[10-11]。大量研究發(fā)現(xiàn)，煙葉的成熟衰老過程和碳氮代謝的變化緊密相關(guān)。在煙葉生長和成熟過程中，以碳水化合物為主的碳積累代謝逐漸增強，而碳的固定和轉(zhuǎn)化代謝逐漸減弱[5]，隨著碳代謝達到一定程度，淀粉的降解大于積累，煙葉成熟度增加，煙葉品質(zhì)提升[2]。隨著煙葉生長和衰老程度加深，總氮和蛋白質(zhì)等氮素營養(yǎng)物質(zhì)的合成速度下降，降解速度增加[12]。在煙葉衰老期，蛋白水解酶被逐漸釋放到細胞質(zhì)，促進蛋白質(zhì)的降解[13]，蛋白質(zhì)的降解使色素蛋白復(fù)合體分解，光合碳同化能力下降，并進一步促進質(zhì)體色素的分解[14]，因而，葉綠素和類胡蘿卜素對衰老十分敏感，其含量下降是煙葉衰老的標志[15]。銨離子是煙葉衰老后期氮素轉(zhuǎn)移和再利用的氮代謝中間體[16-17]，胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶（GS1）定位于胞液中，其在葉片衰老過程中調(diào)控氮源的轉(zhuǎn)移及再利用，而葉綠體谷氨酰胺合成酶（GS2）定位于葉綠體中，主要作用是氨同化[18]。周健飛研究發(fā)現(xiàn)，烤煙葉片葉肉中GS2 蛋白亞基含量隨著葉齡的增長逐漸下降，GS2 活性與質(zhì)外體銨濃度和氨氣揮發(fā)量呈負相關(guān)[19]。而對不同烤煙品種衰老特性與碳氮代謝特征間的關(guān)系還缺乏系統(tǒng)的研究。

本研究選取4 個田間成熟落黃表現(xiàn)不同的烤煙品種，對不同葉齡中部葉中的質(zhì)體色素、碳氮代謝指標及相關(guān)基因表達量的變化差異進行了研究，以期從品種角度解讀烤煙成熟衰老特性差異與碳氮代謝特性的關(guān)系，為調(diào)控煙葉衰老進程、選育適宜衰老特性的品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以田間成熟落黃表現(xiàn)不同的烤煙品種豫煙10號、云煙87、K326 和NC89 為試驗材料。4 個品種在相同的栽培管理條件下，中部葉的發(fā)育進程基本一致，生理成熟期都是在葉齡70 d 左右。種子由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實驗室提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018 年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)進行。供試土壤為肥力一致的輕壤土，基本理化性狀為有機質(zhì)10.77 g/kg、全氮0.96 g/kg、堿解氮48.7 mg/kg，速效磷51.8 mg/kg，速效鉀103.7 mg/kg，pH 7.56。試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)，行距120 cm，株距50 cm。5 月5 日進行移栽，使用煙草專用復(fù)合肥（10-12-18）、重過磷酸鈣和硫酸鉀，純氮用量45 kg/hm2，N : P2O5 : K2O=1 : 2 : 3，基肥與追肥比例為7 : 3，追肥于6 月5 日施入，田間管理參照優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)進行，打頂后單株留葉20 片。參照文獻[20]的方法進行取樣和相關(guān)指標的測定。每個品種分別選取整齊一致的40 至50 株煙，在葉長1.5 cm時標記為葉齡1 d，在葉齡30～70 d，每隔10 d，每個品種每次從3～5 株第10～12 片葉位（自下向上數(shù)）上取適齡葉片，同一樣品取葉片中部后充分剪片混勻分3 份保存，分別用于質(zhì)體色素含量測定，相關(guān)基因表達量測定和殺青后相關(guān)化學(xué)成分測定。

1.3 測定項目及方法

采用分光光度法測定葉綠素、類胡蘿卜素含量[21]?？偟?、總碳用全自動CN分析儀（Vario MAX CN，德國）測定；還原糖、總糖、淀粉含量采用AA3 型連續(xù)流動化學(xué)分析儀（德國 BRAN+LUEBBE 公司生產(chǎn)）測定[22]。

參照文獻[20]的方法計算目的基因的相對表達量，并繪制相關(guān)圖形。以煙草L25 基因為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016 和SPSS21.0 軟件處理和分析試驗數(shù)據(jù)及繪制圖形，用Duncan 法進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種葉片衰老過程中質(zhì)體色素含量變化

4 個烤煙品種中部葉，葉齡30 d 后，葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均隨著葉齡的增大逐漸降低（表2）。不同品種間降低的幅度有較大的差異。豫煙10 號葉綠素含量在葉齡70 d 時顯著低于其他品種（P<0.05），NC89 從葉齡40 d 開始，葉綠素含量均高于其他品種。NC89 的類胡蘿卜素含量在各時期均較高。從葉齡30～70 d，豫煙10 號、云煙87、K326 和NC89 的葉綠素含量降幅分別為53.52%、46.43%、50.19%、43.44%，類胡蘿卜素含量的降幅分別為48.83%、39.13%、44.40%、40.00%。質(zhì)體色素含量的變化和4 個品種中部葉的田間落黃表現(xiàn)相一致。

2.2 不同品種葉片衰老過程中類胡蘿卜素降解基因表達量變化

不同品種葉片成熟衰老過程中，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（CCD）表達量逐漸升高（圖1），品種間有較大的差異。豫煙10 號除葉齡60 d 外其他時期均極顯著高于其他品種。葉齡40 d 時云煙87 和K326 較上一時期有較大增幅，NC89 的表達量在葉齡40 d、50 d 和70 d 均低于其他3 個品種，成熟后期（葉齡70 d）極顯著地低于其他品種（P<0.01）。云煙87 和K326 在葉齡70 d 的表達量居中。不同品種的CCD 表達量與其葉片類胡蘿卜素含量高低趨勢相反，CCD 表達量低，類胡蘿卜素含量相對較高。

圖1 不同品種葉片衰老過程中CCD 基因相對表達量的變化Fig.1 The dynamic changes of CCD gene relative expression in leaves of different flue-tobacco varieties during senescence phase

2.3 不同品種葉片衰老過程中碳代謝相關(guān)指標變化

2.3.1 葉片中淀粉、還原糖、總糖和總碳含量變化

中部葉片衰老過程中，除NC89 外，其他3 個烤煙品種的淀粉含量在40 d 時達到峰值（圖2A），在葉齡40～50 d 間，四個品種中豫煙10 號的淀粉含量降低量最大，NC89 的淀粉含量變化較小。從葉齡40～70 d，豫煙10 號的淀粉含量降幅最大（38.65%），NC89 最?。?7.94%），云煙87 和K326 的淀粉含量變化趨勢一致。還原糖和總糖含量在衰老過程中表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢（圖2B、2C），豫煙10 號的還原糖含量在葉齡50 d 時達到峰值，另外3個品種均在葉齡60 d 時達到峰值。葉齡60～70 d，豫煙10 號、K326、云煙87 和NC89 還原糖含量分別下降16.14%、14.80%、12.52%和10.00%?？偺堑暮烤谌~齡50 d 時達到峰值，葉齡50 d 至70 d，豫煙10 號、K326、云煙87 和NC89 的總糖含量分別下降22.49%、17.72%、20.00%和11.50%。葉片總碳含量在煙葉在衰老過程中維持在46%～50%之間（圖2D），整體表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律，在葉齡40 d 或50 d 時達到峰值后又緩慢下降；葉齡50～60 d 期間，豫煙10 號總碳均極顯著低于其他品種（P ＜0.01），云煙87 和K326 顯著低于NC89（P ＜0.05）；NC89 在整個生長期間均保持較高的總碳含量，葉齡70 d 時，4 個品種間存在顯著的差異（P ＜0.05），表現(xiàn)為NC89>云煙87>豫煙10 號>K326。

圖2 不同品種葉片衰老過程中碳代謝相關(guān)物質(zhì)含量的變化Fig. 2 The dynamic changes of carbon metabolizes nutrients in leaves of different flue-tobacco varieties during leaf senescence phase

2.3.2 葉片中碳代謝相關(guān)基因表達量變化

對葉片中碳代謝相關(guān)基因顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSS1）（圖3A）和淀粉分支酶基因（SBE）（圖3B）的表達量變化分析發(fā)現(xiàn)，兩個淀粉合成關(guān)鍵基因在4 個品種中的表達量均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，且品種間有較大的差異，與淀粉含量在衰老進程中的表現(xiàn)相一致。豫煙10 號兩個基因的表達量在葉齡40 d 前顯著地高于NC89（P<0.05），NC89兩個基因的表達量在葉齡50d 后極顯著地高于其他3個品種（P<0.01）。在葉齡 60 d 和 70 d 時 NC89 的GBSS1 表達量分別是豫煙10 號的2.40 倍和2.05 倍。云煙87 和K326 兩個基因的表達量在葉齡50 d 前差異較大，葉齡50 d 后表達量變化趨勢基本一致。

圖3 葉片衰老過程中碳代謝相關(guān)基因相對表達量的變化Fig. 3 Changes of relative expression of carbon metabolism related genes during leaf senescence phase

2.4 不同品種葉片衰老過程中氮代謝指標變化

2.4.1 葉片中煙堿和總氮含量變化

在相同的栽培管理條件下，葉片成熟衰老過程中，不同品種煙堿和總氮含量的變化具有較大差異（圖4）。NC89 葉片的煙堿含量在成熟衰老過程中均極顯著地高于其他品種（P<0.01），在葉齡60 d和70 d 分別是豫煙10 號含量的1.96 倍和2.10 倍（圖4 A）。葉齡30～50 d，豫煙10 號、云煙87 和K326的煙堿含量差異較小，葉齡60～70 d，豫煙10 號的煙堿含量顯著低于云煙87 和K326。葉片成熟衰老過程中，總氮含量除NC89 從葉齡30～40 d 有小幅上升外，其余品種均表現(xiàn)為下降趨勢（圖4B）；葉齡40～50 d 時豫煙10 號降幅最大，并在葉齡60 d 時顯著低于其他品種，從葉齡30～60 d 豫煙10 號的總氮含量下降27.95%，NC89 僅8.91%。葉片成熟后期（葉齡60～70 d 時），NC89 的總氮含量下降較快，并在葉齡70 d 時顯著低于其他3 個品種。

圖4 不同品種葉片衰老過程中煙堿和總氮含量的變化Fig. 4 The dynamic changes of nicotine and total nitrogen contents in leaves of different flue-tobacco varieties during leaf senescence phase

2.4.2 葉片中氮代謝相關(guān)基因表達量變化

在煙草葉片成熟衰老過程中，調(diào)控氮素轉(zhuǎn)移和再利用的GS1-3 基因相對表達量呈上升趨勢（圖5A），調(diào)控氨同化的GS2 基因相對表達量呈下降趨勢（圖5B），不同品種變化規(guī)律基本一致，但品種間存在較大的差異。豫煙10 號的GS1-3 基因表達量在整個生長衰老期顯著高于其他品種（P<0.05）。葉齡50 d 之后，NC89 品種GS1-3 的表達量均顯著低于其他品種（P<0.05），云煙87 和K326 間的表達量差異較小。NC89 品種GS2 的基因表達量在整個生長衰老期均極顯著地高于豫煙10 號（P<0.01），云煙87 和K326 的GS2 基因表達量的變化幅度居中。說明4 個品種同化利用細胞中各種氮源的方式和能力具有較大差異。

在煙葉成熟衰老過程中，葉片中控制氮素吸收的硝酸還原酶（NR）基因相對表達量逐漸降低（圖5C），豫煙10 號NR 基因的表達量葉齡30 d 時極顯著的高于其他品種（P<0.01），在葉齡50 d 之后均顯著低于其他品種（P<0.05），說明在葉片成熟過程中其氮素同化能力下降較大；NC89 在葉齡60 d 后，NR 基因表達量極顯著的高于其他品種（P<0.01），說明NC89 成熟后期仍保持較高的氮素同化能力。除NC89 外，其他品種調(diào)控氮素轉(zhuǎn)運的谷氨酸脫氫酶基因（GDH1）相對表達量均在葉齡50 d 時達到峰值（圖5D），NC89 在葉齡60 d 時達到峰值。豫煙10 號和K326 的GDH1 表達量在葉齡50 d 之后表達量迅速降低，NC89 和云煙87 還保持較高的表達量，說明NC89 和云煙87 葉片成熟后期仍具有較高的氮素轉(zhuǎn)運能力。

圖5 葉片衰老過程中氮代謝相關(guān)基因相對表達量的變化Fig. 5 Changes of relative expression of nitrogen metabolism related genes in leaves during leaf senescence

2.5 不同品種葉片衰老過程中碳氮比變化

在煙葉的衰老過程中，煙葉碳氮比（C/N）呈逐漸上升的趨勢，4 個品種的碳氮比都在適宜的范圍內(nèi)（表3）。整體上總碳含量變化不大，C/N 的變化主要歸因于總氮含量降低。葉齡50～60 d，豫煙10 號的 C/N 增幅最大，K326 最小；葉齡 60～70 d，NC89 增幅最大，豫煙10 號最小，云煙87 和K326居中。

表3 不同烤煙品種葉片衰老過程中碳氮比的變化Tab. 3 The dynamic changes of C/N ratio in leaves of different flue-cured tobacco varieties during leaf senescence phase

3 討論

碳氮代謝是煙草生長發(fā)育基本的代謝過程[23-24]，不同成熟衰老特性的煙草品種在碳氮代謝過程有較大的差異。本研究表明，成熟衰老較慢的品種NC89 的淀粉和水溶性糖含量的峰值滯后于另外3 個品種，成熟衰老較快的品種豫煙10 號葉齡50 d 后，淀粉合成基因GBSS1 表達量大幅下降，淀粉含量降低，而NC89 的淀粉合成基因GBSS1 表達量和淀粉含量的降幅較小，可能跟豫煙10 號的葉綠素和類胡蘿卜素降解較快較早，影響光合作用有關(guān)。張生杰等[25]對不同品種烤煙葉片衰老和光合特性的研究證實了這一點。豫煙10 號參與氮素轉(zhuǎn)移的GS1-3 基因表達量高，與氮同化相關(guān)的GS2、GDH1 和NR 基因表達量低，氮素轉(zhuǎn)移量大，同化量少，含氮物質(zhì)快速降解，衰老速度加快，可能是其衰老較快的原因，周健飛等對煙草成熟度的研究中也有類似的現(xiàn)象[19]?？梢?，調(diào)控煙葉衰老落黃的關(guān)鍵是在煙葉成熟過程中，控制氮素的同化，增加氮素轉(zhuǎn)移[26]。

煙草的碳氮代謝平衡與其生長發(fā)育和煙葉品質(zhì)緊密相關(guān)。煙草的碳氮代謝受品種、土壤類型、施肥量、施肥種類、水肥管理和生長環(huán)境等眾多因素的影響[27-28]，不同研究者從碳氮代謝相關(guān)酶，代謝關(guān)鍵基因的表達等方面對不同條件下煙草的碳氮代謝規(guī)律進行了研究[29-30]。本研究運用全自動CN 分析儀，對不同品種煙葉的衰老過程中碳氮比變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)中部煙葉C/N 呈逐漸上升，但整體上總碳含量變化不大，C/N 變化主要歸因于總氮含量變化，可能跟本研究是在相同的水肥管理條件下進行，都能正常成熟落黃，4 個品種的C/N 變化主要跟其氮代謝的差異相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同品種的衰老特性除了與其碳氮代謝特征相關(guān)外，還與其遺傳基礎(chǔ)緊密相關(guān)。云煙87 是由K326 和云煙2 號雜交選育的[31]，豫煙10 號是由云煙87 和農(nóng)大202 雜交選育的[32]，云煙87 和K326 具有相似的碳氮代謝和衰老特性，豫煙10 號則與其親本農(nóng)大202 易落黃易烘烤的特性相似。NC89的碳氮代謝和衰老特性，可能與其遺傳基礎(chǔ)特殊有關(guān)。對NC89 碳氮代謝和衰老特性遺傳基礎(chǔ)的深入解讀，將有助于培育適宜衰老落黃特性的優(yōu)良品種。對這幾個材料葉片發(fā)育過程中衰老標志基因表達變化、激素代謝的變化、不同代謝酶類分析等方面的研究也證實了類似的規(guī)律[4,12,20,25-26]。不同煙草品種碳氮代謝和衰老特性差異的原因還可以借鑒水稻等其他作物的研究成果，從根系發(fā)育特性差異[33]、營養(yǎng)吸收利用差異[33]、遺傳基因差異[34]等方面進行深入的研究。

4 結(jié)論

烤煙品種的衰老特性差異與碳氮代謝有關(guān)。與NC89 相比，豫煙10 號中部葉衰老速度快，與其葉齡50 d 后淀粉合成基因GBSS1 表達量下降速度快，淀粉含量降低較快的碳代謝特征，以及葉片成熟衰老過程中氮素轉(zhuǎn)移基因GS1-3 表達量高，氮同化相關(guān)的GS2、GDH1 和NR 基因表達量低，氮素轉(zhuǎn)移量大，同化量少，含氮物質(zhì)快速降解的氮代謝特征相關(guān)。