酶電極法快速測(cè)定加熱卷煙中的甘油含量

趙德清 ，鄧永，郭林青，史健陽(yáng)，王帥鵬，梁坤，韓咚林，黃玉川

1 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，新型煙草研發(fā)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號(hào) 610066；

2 四川三聯(lián)新材料有限公司，新型煙草事業(yè)部，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號(hào) 610066

在新型煙草制品領(lǐng)域，加熱卷煙已經(jīng)成為全球煙草行業(yè)未來(lái)最具發(fā)展?jié)摿Φ难芯繜狳c(diǎn)[1]。傳統(tǒng)卷煙的煙氣氣溶膠是通過(guò)燃燒產(chǎn)生的，加熱卷煙的氣溶膠是在300℃左右的加熱溫度下通過(guò)發(fā)煙劑霧化產(chǎn)生的，甘油是加熱卷煙氣溶膠中的主要組分，也是加熱卷煙所用煙芯材料的主要發(fā)煙劑成分。甘油含量的大小及其穩(wěn)定性顯著影響加熱卷煙的感官質(zhì)量以及煙芯材料的質(zhì)量穩(wěn)定性，因此，快速檢測(cè)加熱卷煙或加熱卷煙用煙芯材料中的甘油含量，是加熱卷煙研究領(lǐng)域的一項(xiàng)基本需求。

煙草及煙草制品中甘油的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[2-7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、拉曼光譜法[12]等。發(fā)酵領(lǐng)域發(fā)酵液中甘油含量的測(cè)定方法有高碘酸氧化法[13-14]、分光光度法[15]、甘油激酶法[16]等。這些方法樣品前處理操作步驟比較繁瑣，較為快速的甘油檢測(cè)試劑盒成本較高。酶電極分析法是利用酶固定化技術(shù)將酶蛋白分子制成固定化酶膜，再與電化學(xué)基礎(chǔ)電極相結(jié)合，構(gòu)成酶電極生物傳感器用于特異性底物分析的一項(xiàng)生物技術(shù)。該方法具有專(zhuān)一性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)快速靈敏等特點(diǎn)。酶電極法在食品、發(fā)酵、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用[17-19]，目前在煙草行業(yè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了一種基于生物傳感器的酶電極分析法，可實(shí)現(xiàn)加熱卷煙中甘油含量的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，旨在為加熱卷煙及加熱卷煙用煙芯材料中甘油含量的調(diào)控提供基礎(chǔ)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：所選加熱卷煙樣品基本涵蓋了國(guó)內(nèi)外主流加熱卷煙品牌，主要包括四種：（1）菲莫公司IQOS加熱卷煙Marlboro HeatSticks 系列和Heets 系列；（2）英美煙草公司Glo 系列；（3）韓國(guó)KT&G 公司lil 系列；（4）四川中煙自制加熱卷煙產(chǎn)品“寬窄EVO”系列，共計(jì)22 個(gè)樣品，具體樣品信息表見(jiàn)表1。

表1 加熱卷煙樣品信息表Tab. 1 Information of HTP cigarette samples

儀器與試劑：M-100 型生物傳感器分析儀（深圳西爾曼科技有限公司）；PerkinElmer Clarus 500 氣相色譜儀（美國(guó)PE 公司，配備FID 氫火焰檢測(cè)器和氫氣發(fā)生器）；SM450 直線型吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）；HY-8 型調(diào)速震蕩儀（昆山超聲波清洗有限公司）；分析天平AG104（0.1 mg，瑞士梅特勒托利公司）；0.45 μm有機(jī)相濾膜（上海迅同機(jī)械有限公司）。甘油標(biāo)準(zhǔn)液（1.0 g/L）、甘油酶膜、緩沖劑由深圳西爾曼科技有限公司提供，甘油、1,4-丁二醇、甲醇均為色譜純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶電極法的測(cè)試原理

酶電極法的測(cè)試原理是甘油通過(guò)醋酸纖維素層到達(dá)固定化甘油酶膜層，在甘油酶膜的催化作用下發(fā)生酶解反應(yīng)迅速產(chǎn)生H2O2，H2O2通過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流，在一定的濃度范圍內(nèi)，甘油濃度與電流信號(hào)呈線性關(guān)系，通過(guò)電極響應(yīng)的電壓差與甘油濃度之間的線性關(guān)系測(cè)定甘油濃度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用超純水將甘油標(biāo)準(zhǔn)液（1.0 g/L）稀釋配制成6 級(jí)甘油標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，用M-100 型生物傳感分析儀測(cè)試甘油標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，記錄初始電壓值和終點(diǎn)電壓值，考察甘油標(biāo)準(zhǔn)液濃度測(cè)定值和對(duì)應(yīng)電壓差之間的線性關(guān)系。

1.2.3 測(cè)定方法

稱(chēng)取0.6～0.8 g 加熱卷煙煙芯材料樣品，精確至0.1 mg，置于250 mL 錐形瓶中，精確加入200 mL 萃取溶劑（萃取液中甘油濃度應(yīng)不超過(guò)1.0 g/L），具塞震蕩萃取一定時(shí)間，靜置萃取液10 min 后進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。M-100 型生物傳感器分析儀自動(dòng)進(jìn)樣、直接讀取數(shù)據(jù)，3 次測(cè)量取平均值作為萃取液的甘油濃度，樣品中甘油含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)W 計(jì)，數(shù)值以%表示，按式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：W—為樣品中甘油含量，單位為%；

c—萃取液中甘油的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；

V——萃取液的體積，單位為毫升（mL）；

m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

w0為試樣水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

結(jié)果以?xún)纱纹叫袦y(cè)定結(jié)果的平均值表示，精確至0.01%。

1.2.4 氣相色譜法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

以1,4-丁二醇為內(nèi)標(biāo)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標(biāo)濃度為5 mg/mL 的萃取劑。配制6 級(jí)甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜測(cè)定，繪制甘油濃度與峰面積比的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)待測(cè)樣品萃取液進(jìn)行色譜測(cè)定，由回歸方程計(jì)算得到樣品的甘油含量。作為舉例，甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品（4.0 mg/mL）的GC 色譜圖見(jiàn)圖1(a)，加熱卷煙樣品（6#）中甘油的GC 色譜圖見(jiàn)圖1(b)。

色譜柱：HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.250 mm, 0.25 μm）；程序升溫：初溫100 ℃（保持1 min），以15℃/min 速率升至220℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；FID 檢測(cè)器溫度275℃；載氣為氦氣，流量為1.5 mL/min，恒流模式；空氣流量450 mL/min；氫氣30 mL/min；尾吹起氦氣25 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比30:1。

圖1 甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液和加熱卷煙樣品中甘油的GC 色譜圖Fig. 1 GC chromatogram of glycerol standard solution (a) and HTP samples (b)

1.2.5 加熱卷煙抽吸實(shí)驗(yàn)

為測(cè)定加熱卷煙中甘油的轉(zhuǎn)移率，選取5 種加熱卷煙進(jìn)行抽吸實(shí)驗(yàn)。采用5 通道直線型吸煙機(jī)進(jìn)行抽吸，抽吸曲線為鐘型，抽吸容量為（55±0.3） mL，單口抽吸時(shí)間2 s，抽吸間隔10 s，每支卷煙抽吸12口，抽吸完后收集煙芯材料的殘?jiān)?，按?.2.3 所示方法進(jìn)行酶電極法測(cè)定甘油含量。甘油轉(zhuǎn)移率按公式（4）進(jìn)行計(jì)算：

式中：R 為甘油的轉(zhuǎn)移率，單位為%；M0為加熱卷煙抽吸前甘油含量，單位為mg/支；M1為加熱卷煙抽吸后殘?jiān)懈视秃浚瑔挝粸閙g/支。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑的選擇

煙草及煙草制品中甘油的測(cè)定常用的萃取劑有水、甲醇、異丙醇等，高效液相色譜法一般采用水作為萃取劑[8-9]，氣相色譜法多采用甲醇作為萃取劑[2-7]，也有一些文獻(xiàn)采用異丙醇作為甘油的萃取劑[3]。本實(shí)驗(yàn)考察了水、甲醇、異丙醇3 種萃取劑對(duì)加熱卷煙中甘油的萃取效果（表2），結(jié)果表明，同一試樣以甲醇作為萃取劑時(shí)甘油含量測(cè)定結(jié)果最高，為16.49%，其次是水，最低的是異丙醇。以甲醇的萃取率作為基準(zhǔn)，水的萃取率為甲醇的86%，異丙醇的萃取率只有甲醇的56%，因此選擇甲醇作為萃取劑。

表2 不同萃取劑測(cè)得的加熱卷煙試樣甘油含量Tab. 2 Contents of glycerol in HTP cigarettes using different extractants %

2.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

分別以水和甲醇作為萃取劑，考察了不同萃取時(shí)間對(duì)甘油測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明（表3），隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，甘油的測(cè)定結(jié)果并沒(méi)有出現(xiàn)顯著增加，在萃取時(shí)間達(dá)到1 h 時(shí)甘油萃取率基本達(dá)到頂點(diǎn)，無(wú)論以水還是甲醇作為萃取劑，在1 h 時(shí)甘油測(cè)定結(jié)果基本趨于穩(wěn)定，所以選取萃取時(shí)間為1 h。

表3 不同萃取時(shí)間測(cè)得的甘油含量Tab. 3 Contents of glycerol in HTP cigarettes with different extraction time %

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以6 級(jí)甘油標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行酶電極法測(cè)定，記錄甘油濃度檢測(cè)值、初始電壓值、終點(diǎn)電壓值和電壓差，結(jié)果見(jiàn)表4 所示。以電壓差（y）對(duì)甘油濃度（x）做線性回歸分析，建立酶電極法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖2），得到線性方程為y = 531.02x+0.7223，確定系數(shù)R2為0.9998，表明酶電極法的甘油標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性良好。將最低濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg/mL）重復(fù)測(cè)定10次，以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法的檢出限和定量限，得到酶電極法甘油的檢出限為0.045 mg/mL，定量限為0.149 mg/mL。

表4 不同濃度梯度甘油標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)結(jié)果Tab. 4 Test result of glycerol standard solution with different concentration gradient

圖2 酶電極法甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of glycerol with enzyme electrode method

2.4 方法的回收率與精密度

選取3 個(gè)加熱卷煙樣品2#、3#、4#，分別以低、中、高3 個(gè)梯度水平添加甘油標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明（表5），3 個(gè)樣品的加標(biāo)回收率范圍為97.64%～102.32%，可見(jiàn)酶電極法測(cè)定甘油的正確度較高，滿(mǎn)足樣品測(cè)試要求。選取1 個(gè)加熱卷煙樣品（5#），進(jìn)行6 個(gè)平行樣測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果的RSD=2.15%(n=6)（表6），表明該方法的重復(fù)性較好，精密度較高。

表5 酶電極法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab. 5 Spiked recoveries of enzyme electrode method

表6 酶電極法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 6 Repeatability test results of enzyme electrode method %

2.5 方法的準(zhǔn)確性

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，選取有代表性的12 個(gè)加熱卷煙樣品，其中6#～9#為Marlboro HeatSticks 系列，10#～13#為Heets 系列，14#～17#為四川中煙“寬窄”系列，分別采用酶電極法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法氣相色譜法[5]進(jìn)行甘油含量測(cè)試，采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，并且對(duì)兩種方法的線性相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表7、表8 和圖3 所示。從表7 可以看出，酶電極法與氣相色譜法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好。從圖3 可以看出，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.8553x+0.0267，決定系數(shù)R2=0.9807。從表8 可以看出，12 個(gè)樣品兩配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)的雙尾概率P 值為0.202 ＞0.05，95%置信區(qū)間的差分下限和上限分別為-0.3363 和-0.0798，說(shuō)明兩種分析方法的檢測(cè)結(jié)果一致，二者之間不存在顯著差異。

表7 12 個(gè)加熱卷煙樣品中甘油含量測(cè)試結(jié)果Tab. 7 Testing results of glycerol content in twelve HTP samples

表8 12 個(gè)加熱卷煙樣品的兩配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Paired samples T test results of twelve HTP samples

圖3 酶電極法與氣相色譜法檢測(cè)結(jié)果之間的線性關(guān)系Fig. 3 Linear relationship between detection results of enzyme electrode method and gas chromatography

2.6 方法的應(yīng)用

加熱卷煙中的甘油（VG）在加熱抽吸過(guò)程中會(huì)部分轉(zhuǎn)移至煙氣氣溶膠中，利用酶電極法對(duì)加熱卷煙抽吸前煙芯材料、抽吸后煙芯材料殘?jiān)械母视秃窟M(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到甘油的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表9 所示。從表9 中可以看出，18#～20#樣品對(duì)應(yīng)的IQOS 加熱卷煙Marlboro 和HEETS 系列，其甘油轉(zhuǎn)移率范圍為36%～41%，而21#、22#樣品對(duì)應(yīng)的“寬窄EVO”系列，其甘油轉(zhuǎn)移率范圍為33%～34%。

表9 加熱卷煙甘油轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果Tab. 9 Transfer rates of glycerol of HTP cigarettes

3 結(jié)論

建立了一種利用甘油酶電極生物傳感器原理快速測(cè)定加熱卷煙中甘油含量的方法，以甲醇作為萃取劑，振蕩萃取1 h，通過(guò)酶電極法測(cè)得的加熱卷煙甘油含量與氣相色譜法具有較好的一致性，二者之間呈顯著線性相關(guān)關(guān)系，配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種方法測(cè)定結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確性均較好。與氣相色譜法相比，酶電極法具有酶專(zhuān)一性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)快速靈敏等特點(diǎn)，適合加熱卷煙中甘油含量的快速檢測(cè)。