竹柏果油提取工藝優(yōu)化及理化特性分析

呂露露 楊崇文 李承勇, 孫省利, 閆協(xié)民 蘇添添 馮彥婷

(1. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088;2. 湛江市海岸帶生態(tài)工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524088)

人體血清中總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇含量過高易誘發(fā)冠心病和腦梗死[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸可參與膽固醇酯化過程，提高不飽和脂肪酸的攝入量可降低血清中膽固醇的含量。為此，尋找自然界中優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸的來源，尤其是具有顯著生物活性的長鏈不飽和脂肪酸(C20以上)已成為科研人員關(guān)注的熱點[4]。然而由于漁業(yè)資源日益減少，有效成分及純度符合要求的長鏈不飽和酸原料十分有限(主要集中于沙丁魚、三文魚、金槍魚等深海魚類)，再加上提純工藝繁瑣復(fù)雜等問題使得開發(fā)成本較高。雖然植物油脂提純工藝相對簡單且成本可觀，但其脂肪酸組成中長鏈不飽和脂肪酸的比例一般較低。

竹柏(Podocarpusnagi)為羅漢松科(Podocarpacese)羅漢松屬植物，是古老的裸子植物，起源于中生代白堊紀(jì)，被人們稱為“活化石”[5]。竹柏作為常綠喬木，在中國主要分布于華南地區(qū)、臺灣和云南南部，越南、柬埔寨也有分布[6]。竹柏根莖及枝葉中含有多種活性成分，包括黃酮、環(huán)肽及二萜類化合物等，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，為各地植物志所記載[7]。竹柏經(jīng)種子繁殖后10年左右可開花結(jié)果，其果仁含油量較高。有數(shù)據(jù)顯示，竹柏盛果期單株產(chǎn)果高，種子含油量可達(dá)30%[8]，但其脂肪酸的含量及成分還尚不明確。目前關(guān)于竹柏的研究主要集中在葉子和枝干等方面，謝黛等[9]在竹柏葉中提取出了黃酮物質(zhì)，而劉娟等[10]對長葉竹柏的葉子和枝干的化學(xué)成分進(jìn)行了分離與鑒定。但對于竹柏果實成分和應(yīng)用的研究還未有報道。本試驗擬以成熟的竹柏果為原料，對超聲波輔助索氏抽提竹柏果油的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究該油脂的基本理化性質(zhì)及脂肪酸組成，為提取不飽和脂肪酸尤其是長鏈不飽和脂肪酸提供更多的來源，并為后期竹柏果實中竹柏果油的提取純化工藝和竹柏資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

竹柏果：廉江市某種植基地，經(jīng)曬干于-20 ℃冰箱儲存，使用前去皮、殼，取其果仁；

所用試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

超聲波清洗機(jī)：JP-040S型，深圳市潔盟清潔設(shè)備有限公司；

萬分之一電子天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

超純水一體機(jī)：D24-UV型，默克密理博試驗室設(shè)備(上海)有限公司；

臺式高速大容量冷凍離心機(jī)：5810R型，艾本德中國有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-O(Ⅲ) 型，鞏義市予華儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-3000B型，鞏義市予華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司；

冷凝水泵：CCA-20型，鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將竹柏果仁經(jīng)超純水充分清洗后先于60 ℃ 烘箱中干燥待其自然冷卻后研磨備用。

1.2.2 基本成分和理化指標(biāo)測定

(1) 粗蛋白：參照文獻(xiàn)[11]。

(2) 粗脂肪：參照文獻(xiàn)[12]。

(3) 灰分：參照文獻(xiàn)[13]。

(4) 酸值、過氧化值、水分及揮發(fā)物、碘值和皂化值：按GB/T 5528—2008系列方法執(zhí)行。

1.2.3 提取率的測定 稱取4.0 g經(jīng)研磨的竹柏果仁，用濾紙包裹好置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷，用超聲波清洗機(jī)(功率：240 W，溫度：25 ℃)超聲6 min 后，將樣品濾紙包放入抽提筒中，將提取溶劑倒進(jìn)250 mL 平底燒瓶中，于75 ℃水浴加熱，回流150 min。提取結(jié)束后將提取液過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾、干燥、恒重，按式(1)計算竹柏果仁油提取率。

(1)

式中：

R——竹柏果油提取率，%；

m1——竹柏果仁油質(zhì)量，g；

m2——竹柏果仁粉質(zhì)量，g。

1.2.4 竹柏果油提取工藝優(yōu)化

(1) 提取溶劑的選擇：固定超聲時間6 min，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察正己烷、石油醚、乙酸乙酯對竹柏果油得率的影響。

(2) 超聲時間的選擇：固定提取溶劑為正己烷，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同超聲時間(2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 min)對竹柏果油得率的影響。

(3) 提取溫度的選擇：固定提取溶劑為正己烷，超聲時間6 min，提取時間150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同提取溫度(60，65，70，75，80，85，90 ℃)對竹柏果油得率的影響。

(4) 提取時間的選擇：固定提取溶劑為正己烷，超聲時間6 min，提取溫度75 ℃，料液比1∶40 (g/mL)，分別考察不同提取時間(60，90，120，150，180，210，240 min)對竹柏果油得率的影響。

(5) 料液比的選擇：固定提取溶劑為正己烷，提取溫度75 ℃，提取時間150 min，超聲時間6 min，分別考察不同料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100，1∶110 (g/mL)]對竹柏果油得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化竹柏果油提取工藝 以單因素結(jié)果為基礎(chǔ)，選取提取溫度、回流時間、料液比3個因素設(shè)計正交試驗，每個因素設(shè)置3個水平，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 脂肪酸組成分析

(1) 甲酯化：取竹柏果油20 mg于50 mL平底燒瓶中，加入2 mL正己烷充分渦旋溶解后，再加入2% 氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL混勻，置于60 ℃水浴鍋加熱，直至液面上的油滴消失，加入濃度為16%的三氟化硼溶液2 mL，加熱15 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入50 mL比色管中，用飽和氯化鈉溶液清洗平底燒瓶，并轉(zhuǎn)入比色管中，振蕩1～2 min，靜置10 min，取比色管中上清液過0.2 μm微孔濾膜到進(jìn)樣瓶，作為GC-MS分析試樣[14]。

(2) GC-MS分析：載氣是高純氮氣；色譜柱初始溫度為50 ℃，恒溫0.5 min后，以55 ℃/min升至155 ℃，再以8 ℃/min 升至175 ℃，然后以1.2 ℃/min升至187 ℃，最后以9 ℃/min升至280 ℃[15]；色譜柱為HP-530 m×0.25 mm×0.25 μm彈性石英毛細(xì)管柱[16]。進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL；分流比100∶1；掃描模式SCAN，SIM；He流速45 cm/s。

(3) 定量分析：將100 mg混合標(biāo)準(zhǔn)樣品用正己烷溶解，并定容至2 mL得濃度為50 mg/mL，再用正己烷分別稀釋至40.0，25.0，10.0，5.0，2.0，0.6 mg/mL系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用GC-MS/SIM對其進(jìn)行分析，以峰面積和質(zhì)量濃度作定量工作曲線。使用相同的GC-MS操作條件和過程來分析竹柏果仁油試樣，并基于定量離子的響應(yīng)值和建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對定量[17]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5、SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑對竹柏果油得率的影響 由圖1可知，乙酸乙酯提取率最高，與石油醚相比差異不明顯(P>0.05)，與正己烷相比差異顯著(P<0.05)。乙酸乙酯提取油量最大的原因，可能與乙酸乙酯的極性較大有關(guān)，也可能是竹柏果仁油以不飽和脂肪酸為主，其中的不飽和雙鍵能與乙酸乙酯反應(yīng)形成新的價鍵，并且加入乙酸乙酯后，油脂的初始運動黏度降低[18]，有助于油脂在乙酸乙酯中的溶解。這兩方面的原因使乙酸乙酯對竹柏果仁油的提取率最高。提取溶劑對得油率有很大的影響，合適的提取溶劑不僅能使油料細(xì)胞在超聲情況下發(fā)生破碎，還能使油料中的有效成分充分溶出。由于乙酸乙酯價格較高，并且可能造成油樣成分損失，石油醚的毒性較高，危險性大。因此綜合考慮提取效果、經(jīng)濟(jì)成本和安全問題，選用正己烷為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)試驗。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 溶劑對竹柏果出油率的影響Figure 1 Effect of different solvents on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.1.2 超聲時間對竹柏果油得率的影響 由圖2可知，超聲時間6 min前，竹柏果油提取率隨著時間的延長而增加，在6～12 min時竹柏果油的提取率變化較為平緩，差異不顯著，在14 min時出現(xiàn)上升趨勢后又趨于平緩，甚至低于6 min的提取率，可能是超聲加速了正己烷的揮發(fā)所致。同時，長時間超聲，能量消耗較大。因此，選擇超聲時間為6 min 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.3 提取溫度對竹柏果油得率的影響 由圖3可知，溫度低于70 ℃，竹柏果油提取率隨著提取溫度的上升而增加，溫度的上升會促進(jìn)溶劑對物料的滲透；在70～85 ℃時提取率的變化趨于穩(wěn)定；而高于85 ℃，提取率逐漸下降，可能是溫度過高，溶劑的蒸發(fā)速度加快，對樣品的浸提時間減少，使得提取率下降。因此，最終選定65～75 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.4 提取時間對竹柏果油得率的影響 由圖4可知，提取時間在150 min以前隨著提取時間的延長，竹柏果油的提取率增長較快，超過150 min后，提取率變化不顯著。為此應(yīng)選擇150 min為響應(yīng)面優(yōu)化試驗的中心點。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 超聲時間對竹柏果出油率的影響Figure 2 Effect of change of ultrasonic time on the oil yield rate Podocarpus nagi

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 提取溫度對竹柏果出油率的影響

Figure 3 Effect of change of extraction temperature on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 提取時間對竹柏果出油率的影響

Figure 4 Effect of change of extraction time on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

2.1.5 料液比對竹柏果油得率的影響 由圖5可知，隨著提取劑的增加，反應(yīng)體系的滲透壓越大，竹柏果油在溶劑中的擴(kuò)散速度也會提高，提取率隨之上升。當(dāng)料液比超過1∶40 (g/mL)后，竹柏果油提取率的增加不明顯，趨于平緩。進(jìn)一步增加提取劑會增加提取成本。因此，選擇料液比1∶40 (g/mL)為響應(yīng)面試驗的中心點。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖5 料液比對竹柏果出油率的影響Figure 5 Effect of change of liquid ratio on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計及結(jié)果分析 以竹柏果仁油提取率(R)為響應(yīng)值，選擇提取溫度、提取時間、料液比3個因素設(shè)計正交試驗，每個因素設(shè)置3個水平，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

使用Design expert 8.0.6軟件對模型列回歸方程，得到竹柏果仁油得率對提取溫度、回流時間、料液比的二次多項回歸模型方程：

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

(2)

不同因子交互作用的3D響應(yīng)面圖見圖6～8，結(jié)合回歸模型X1X2、X1X3和X2X3的P值大小分析知，X1(提取溫度)和X3(料液比)對到竹柏果仁油提取率的交互作用相對明顯。

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression model analysis of variance

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

圖6 提取溫度與提取時間的交互作用Figure 6 Interactive effects extraction temperature and extraction time

圖7 提取溫度與料液比的交互作用Figure 7 Interactive effects extraction temperature and solid-liquid ratio

2.3 驗證性實驗

采用Design-expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，得最適提取條件為料液比1∶42.89 (g/mL)、提取溫度73.16 ℃、提取時間166.15 min，預(yù)測竹柏果仁油提取率31.22%。結(jié)合單因素優(yōu)化結(jié)果并考慮到實際試驗操作條件，提取工藝修正為：料液比1∶40 (g/mL)、提取溫度75 ℃、提取時間150 min。此條件下進(jìn)行實驗驗證，設(shè)置4次平行實驗。得到竹柏果油的平均提取率為29.32%，由于竹柏果實存在著不同的成熟度，會導(dǎo)致提取竹柏果油時有一定的誤差。與模型預(yù)測值誤差為8.99%，與預(yù)期相近。

圖8 提取時間與料液比的交互作用Figure 8 Interactive effects extraction time and solid-liquid ratio

2.4 理化指標(biāo)分析

由表4可知，經(jīng)檢測，竹柏果仁油所測的各項理化指標(biāo)符合GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品。按照QB/T 4079—2010《按摩基礎(chǔ)油、按摩油》的要求，過氧化氫值≤10 mmol/kg，竹柏果仁油的過氧化氫值為27.76 mmol/kg，通過后期提取工藝的進(jìn)一步改進(jìn)與油脂精煉可用于化妝品行業(yè)。

表4 竹柏果仁油的理化性質(zhì)?Table 4 The physicochemical properties of Podocarpus nagi nut oil

? *表示重復(fù)3次，**表示重復(fù)2次。

2.5 GC-MS分析

采用選擇性離子檢測的GC-MS方法對9種脂肪酸甲酯的總離子流圖進(jìn)行掃描，得到竹柏果仁油樣品的總離子流圖見圖9，9種脂肪酸甲酯的含量見表5。

1. 十六碳酸 2. 十八碳酸 3. 十八碳一烯酸 4. 十八碳二烯酸 5. 十八碳三烯酸 6. 二十碳酸 7. 二十碳一烯酸 8. 二十碳二烯酸 9. 二十碳三烯酸

圖9 竹柏果油GC-MS總離子流Figure 9 Total ion flow of GC-MS in Podocarpus nagi nut oil表5 竹柏果仁油GC-MS成分分析結(jié)果Table 5 Analysis results of GC-MS composition of oil in Podocarpus nagi nut oil

由表5可知，竹柏果仁油主要化學(xué)成分為脂肪酸類，鑒別出9種脂肪酸，以亞油酸、二十碳三烯酸、十八碳一烯酸為主，不飽和脂肪酸含量達(dá)到95.81%，其中C20以上的長鏈不飽和脂肪酸占脂肪酸組成的33.76%。不飽和脂肪酸對人類健康大有裨益，可軟化血管、降低低密度脂蛋白和膽固醇、增強(qiáng)視力等作用[18]，其中亞油酸具有降低血中膽固醇、調(diào)節(jié)脂肪代謝、抑制或清除動脈血栓等作用。竹柏果仁油富含長鏈不飽和脂肪酸，在保健品領(lǐng)域有極大的開發(fā)前景。

3 結(jié)論

本試驗以成熟的竹柏果為原料，優(yōu)化了超聲波輔助索氏抽提法提取竹柏果仁油的工藝條件，并研究了該油脂的基本理化性質(zhì)及脂肪酸組成。研究發(fā)現(xiàn)，竹柏果仁油中不飽和脂肪酸含量達(dá)95.81%，且多不飽和脂肪酸總量為76.27%，顯著高于單不飽和脂肪酸。竹柏果仁油亞油酸含量相比同類陸生食用油脂優(yōu)勢明顯，C20以上的長鏈不飽和脂肪酸占脂肪酸組成的33.76%。本試驗尚未對竹柏果仁油中不飽和脂肪酸的應(yīng)用進(jìn)行開發(fā)，有待進(jìn)一步研究。