新疆喀什長(zhǎng)壽老人腸道益生菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

阿依米熱·毛拉木 努斯熱提古麗·安外爾 布沙熱木·阿布力孜 海米代·吾拉木 烏斯?jié)M·依米提

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

人體腸道是微生物良好的棲息環(huán)境，成人腸道中的微生物數(shù)量多達(dá)1013～1014個(gè)、共15 000～36 000種，總重量達(dá)1.5 kg[1]。腸道微生物是人體最龐大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，具有人體不具備的代謝功能。腸道微生物及其代謝產(chǎn)物不僅能提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)消化[2]，還能抑制病原體的侵襲[3]、影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和大腦活動(dòng)[4]。Komai等[5]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)壽老人腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳桿菌等乳酸菌數(shù)量多于普通人群，說(shuō)明腸道中的乳酸菌對(duì)人體的健康和長(zhǎng)壽有一定的促進(jìn)作用。但是腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病、冠心病等慢性疾病的發(fā)生[6-7]。益生菌和益生元是調(diào)理腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的兩大腸道活力因子。益生菌是對(duì)宿主有益的一類微生物活體，它定植于人體腸道和生殖系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生一定的功效從而改善宿主的微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用。大量研究[8-9][10]23-24發(fā)現(xiàn)乳酸菌在降低血清中的血脂水平方面具有顯著功能，并且副作用較低。盡管乳酸菌對(duì)人體的有益作用較為突出，由于不同人的腸道菌群之間存在差異[11]，宿主與腸道微生物菌群之間存在著相互選擇的關(guān)系，因此不同人群對(duì)同種菌株的適應(yīng)性及不同來(lái)源菌株對(duì)人體腸道的適應(yīng)能力不同[12]。目前中國(guó)的益生菌產(chǎn)品多以非人源益生菌為主，忽略了菌株的來(lái)源與作用對(duì)象一致時(shí)，菌株對(duì)宿主益生功效的針對(duì)性和特異性才會(huì)增強(qiáng)[13]。

本試驗(yàn)擬從世界公認(rèn)的長(zhǎng)壽地區(qū)喀什長(zhǎng)壽老人腸道中分離篩選降甘油三酯乳酸菌，通過(guò)體外試驗(yàn)獲得對(duì)胃酸和膽汁鹽具有一定耐受性的人源益生菌，對(duì)人體腸道具有更高的適應(yīng)性和安全性等優(yōu)點(diǎn)，可以將其直接應(yīng)用于人體或乳制品，為開(kāi)發(fā)和利用人源益生菌提供菌種資源儲(chǔ)備和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

2016年2月從喀什地區(qū)疏勒縣庫(kù)木西力克鄉(xiāng)采集長(zhǎng)壽(80歲以上)老人糞便樣品一共10份。庫(kù)木西力克鄉(xiāng)是長(zhǎng)壽老人集中的鄉(xiāng)村，提供樣品者長(zhǎng)期飲食結(jié)構(gòu)大多以牛奶、羊肉為蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，日常食物有小麥、玉米和高粱，水果和堅(jiān)果是每日必不可少的部分。樣品提供者均為長(zhǎng)期堅(jiān)持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)勞動(dòng)的農(nóng)民。對(duì)照組為普通農(nóng)民的糞便一共2份，并保證采樣前2周內(nèi)沒(méi)有服用過(guò)任何菌類藥物，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Table 1 The information of samples

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

甘油三酯試劑盒(TG)、膽鹽：四川邁克生物科技股份有限公司；

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶、Taq聚合酶：上海生工生物工程股份有限公司；

改良MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂粉20 g，碳酸鈣20 g，吐溫1 mL；

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉18 g；

甘油三酯培養(yǎng)基：將2 g/L的聚乙烯醇水溶液與植物油按體積比3∶1混合，用超聲波處理(控制參數(shù)每次超聲5 s，間隔時(shí)間5 s，共超聲70次)后，加入到MRS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用；

人工胃液：5 g/L的NaCl溶液、3 g/L的胃蛋白酶溶液，用1.0 mol/L的HCl調(diào)pH至3.0，0.22 L濾器過(guò)濾除菌[10]，4 ℃冰箱冷藏，備用；

膽鹽培養(yǎng)基：稱取膽鹽于MRS 液體培養(yǎng)基中，配制濃度為成1，3，5 g/L膽鹽溶液[10]35，調(diào)pH至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.1.3 主要儀器

全自動(dòng)滅菌鍋：JF-SX-500型，日本TOMY公司；

生化培養(yǎng)箱：DP-200型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司：

分光光度計(jì)：NanoDrop 2000c型，賽默飛世爾科技公司；

PCR儀：S1000 Thermal Cycler型，北京伯樂(lè)元業(yè)有限責(zé)任公司；

電子天平：JD200-3型，沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；

凝膠成像：bioradchemidoc XRS型，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)壽老人與普通人細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定及比較 分別稱取1.0 g長(zhǎng)壽老人和普通人糞便樣品，倒入9.0 mL無(wú)菌水中，吸取稀釋液1 mL進(jìn)行梯度稀釋，得到10-2～10-5個(gè)稀釋度，涂布于LB培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，記錄菌落總數(shù)，進(jìn)行比較。在改良MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，挑選形成鈣溶圈的菌落，2組進(jìn)行乳酸菌數(shù)量比較。

1.2.2 乳酸菌的分離、純化及形態(tài)學(xué)觀察 將新疆喀什地區(qū)維吾爾族長(zhǎng)壽(80歲以上)老人采集的糞便樣品梯度稀釋，平板涂布于改良MRS培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形態(tài)將不同菌落進(jìn)行編號(hào)，并挑取形態(tài)不同的菌落反復(fù)劃線于LB培養(yǎng)基分離獲得純菌落。對(duì)分離獲得的41株菌株進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶接觸試驗(yàn)。將革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶為陰性的菌株初步判斷為乳酸菌[14]。

1.2.3 乳酸菌體外甘油三酯降解率、耐酸耐膽鹽能力的測(cè)定

將乳酸菌按3%的接種量接種至甘油三酯培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，10 000×g離心2 min，取上清液用于甘油三酯降解率的測(cè)定，以沒(méi)有接菌的甘油三酯培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，利用甘油三酯試劑盒測(cè)定甘油三酯的含量[15]。甘油三酯含量和甘油三酯降解率分別按式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

C1——樣品的甘油三酯含量，mg/mL；

A1——接種乳酸菌的含甘油三酯的MRS液體培養(yǎng)基中測(cè)得的甘油三酯OD值；

A2——標(biāo)準(zhǔn)液的OD值；

C——標(biāo)準(zhǔn)液的含量，mg/mL；

R——甘油三酯降解率，%；

C2——總甘油三酯含量，mg/mL。

將1.0 mL乳酸菌菌液接種至9.0 mL pH為3.0的人工胃液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，依次在0，3 h時(shí)進(jìn)行取樣，測(cè)定活菌數(shù)，存活率按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

在實(shí)驗(yàn)中，我們將事先錄好的鐵路監(jiān)控視頻，作為輸入圖像導(dǎo)入到關(guān)鍵幀提取器，通過(guò)SIFT特征提取和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的深度特征提取，自動(dòng)調(diào)整網(wǎng)絡(luò)參數(shù)和權(quán)重，實(shí)現(xiàn)基于深度學(xué)習(xí)的目標(biāo)檢測(cè)提取視頻圖像關(guān)鍵幀，提取出視頻的關(guān)鍵幀圖像如圖4所示。

S——存活率，%；

N1——3 h的活菌數(shù)，CFU/mL；

N2——0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

將乳酸菌按3%的接種量分別接種至含1，3，5 g/L的膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，依次在0，3 h時(shí)進(jìn)行取樣，測(cè)定活菌數(shù)，按式(3)計(jì)算存活率。

1.2.4 16S rDNA序列鑒定 參照DNA提取試劑盒方法，提取乳酸菌基因組DNA，對(duì)乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得到的序列通過(guò)BLAST程序比對(duì)，鑒定菌屬信息。

將提取所得的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用正向引物27f:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1492R:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。PCR反應(yīng)體系(50 mL)：各引物1 mL；mix 24 mL；模板1 mL；超純水補(bǔ)足至50 mL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物6 mL，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳液為0.5%×TBE。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Prism 5作圖，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

表2為新疆喀什長(zhǎng)壽老人和普通人腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌和乳酸菌總數(shù)的比較。由表2可以看出，長(zhǎng)壽老人腸道中的細(xì)菌總數(shù)比普通人的少，但長(zhǎng)壽老人腸道中乳酸菌占的比例顯著高于普通人的。麥熱姆妮薩·艾麥爾等[16]研究發(fā)現(xiàn)，

表2 樣品的細(xì)菌總數(shù)Table 2 Total bacterial count

和田長(zhǎng)壽老人的腸道益生菌在數(shù)量和種類上均與普通人群有差異，且長(zhǎng)壽老人腸道內(nèi)的益生乳酸菌的數(shù)量比普通人群腸道內(nèi)的多，主要是腸球菌和植物乳桿菌占優(yōu)勢(shì)。研究[5,17-18]顯示中國(guó)巴馬地區(qū)和俄羅斯高加索長(zhǎng)壽地區(qū)人群腸道中的益生乳酸菌數(shù)量明顯高于普通人。表明人的健康與長(zhǎng)壽均與腸道中的益生乳酸菌相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

2.2 乳酸菌的分離、純化及初步鑒定

利用改良MRS培養(yǎng)基從長(zhǎng)壽老人組分離得到41株乳酸菌，各菌落皆為乳白色，表面光滑、整齊，形成鈣溶圈，直徑為1～3 mm；皆為革蘭氏陽(yáng)性，形狀為桿狀、短桿狀或球狀，均為過(guò)氧化氫酶陰性。

2.3 乳酸菌的體外降甘油三酯能力的測(cè)定

由表3可知，不同來(lái)源的乳酸菌的甘油三酯降解率差異較大，41株乳酸菌中，A1-2和A1-10的甘油三酯降解能力最強(qiáng)，降解率分別為39.38%，32.33%。其次有12株菌的降解率在15%～30%，18株菌在5%～15%，9株菌在5%以下。

表3 乳酸菌降解甘油三酯的能力Table 3 Abilities of lowering riglycerids by lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測(cè)定

將14株甘油三酯降解率>15%的乳酸菌接入pH為3.0 的人工胃液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在0，3 h時(shí)進(jìn)行取樣，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算存活率。由圖1(a)可以看出，乳酸菌在pH為3.0的人工胃液中存活率均超過(guò)12.00%，其中A2-1、A1-2、A3-1、A4-6及A4-1的存活率>50%，分別為63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%。乳酸菌能夠在酸性條件下存活，可能是因?yàn)槠浼?xì)胞質(zhì)中的pH值始終保持在一個(gè)適宜的水平，而F1F0-ATP酶在維持乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的pH 起到至關(guān)重要的作用[19]，人體腸道中的低pH 環(huán)境也增加了F1F0-ATP酶的活性[20]，因此，試驗(yàn)中不同乳酸菌耐酸能力有較大的差異，可能與菌體的來(lái)源，即個(gè)體腸道內(nèi)環(huán)境的差異有一定的關(guān)系[21]。

不同字母表示具有差異性(P<0.01)圖1 乳酸菌在初始pH為3.0及1，3，5 g/L膽鹽溶液中的存活率Figure 1 The survival rate of lactic acid bacteria in the initial pH of 3.0 and 1, 3, 5 g/L bile salt solution (n=3)

由圖1(b)～(d)可以看出，在1，3，5 g/L 膽鹽溶液中的存活率>10.00%的菌株共6株，為A1-2、A2-2、A3-1、A2-1、A1-8及A4-6，這6株菌的耐膽鹽能力顯著大于其他菌株(P<0.01)。同一菌株隨著膽鹽濃度的升高，存活率反而降低。

2.5 菌株16S rDNA測(cè)序鑒定

對(duì)耐酸耐膽鹽能力較強(qiáng)的5株乳酸菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，送去上海生工測(cè)序。應(yīng)用BLAST對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì)，從GenBank中選取相關(guān)種屬菌株16S rDNA序列，應(yīng)用Cluxtal X雙重比對(duì)，用MEGA 5.0軟件進(jìn)行相似性分析(表4)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖2)。結(jié)果表明，A1-2與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1，A3-1，A4-6與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1與干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)的同源性達(dá)到99%。

圖2 5株分離菌根據(jù)相關(guān)16S rDNA序列建立的遺傳進(jìn)化樹(shù)Figure 2 The genetic evolutionary tree of 5 isolated bacteria strain in accordance with the 16S rDNA sequences表4 16S rDNA序列比對(duì)鑒定結(jié)果Table 4 The identification result by alignment of 16S rDNA sequences

菌株親緣關(guān)系最近的菌株同源性/%A1-2Lactobacillus plantarum99A2-1Enterococcus faecium99A3-1Enterococcus faecium99A4-6Enterococcus faecium99A4-1Lactobacillus paracasei99

3 結(jié)論

本研究從喀什長(zhǎng)壽老人糞便中分離獲得41珠乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行了降甘油三酯能力試驗(yàn)，篩選出14珠甘油三酯降解率>15%的菌株，進(jìn)行胃酸，膽汁鹽耐受試驗(yàn)。研究[22]表明，人的胃液pH值為3.0左右，空腹或食用酸性食品時(shí)的pH為1.50，小腸的膽汁鹽含量為0.03%～0.30%。對(duì)酸和膽鹽耐受性較低的乳酸菌在此環(huán)境下無(wú)法存活，因此從長(zhǎng)壽老人樣品中分離獲得的乳酸菌具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力。其中A2-1，A1-2，A3-1，A4-6，A4-1在pH為3.0的人工胃液中有一定的耐受性，在人工胃液培養(yǎng)3 h的存活率分別為63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%，并在膽鹽濃度分別為1，3，5 g/L的MRS培養(yǎng)基中存活率較高，其中A1-2的耐膽鹽能力最強(qiáng)，在膽鹽濃度為1，3，5 g/L的MRS培養(yǎng)基中的存活率分別為46.03%，41.81%，15.77%。經(jīng)分子鑒定可知，A1-2為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1、A3-1、A4-6為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1為干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)菌株A1-2具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力，且該菌株為人源性，有較高的安全性，為以后的人源益生菌的開(kāi)發(fā)提供新的菌種資源。