Quinadoline C
——海南海桑內(nèi)生真菌的一種新生物堿

郭志凱，蓋翠娟，蔡彩虹，曾艷波，袁靖喆，梅文莉，戴好富

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101

海洋蘊(yùn)藏了豐富的生物資源，是藥物先導(dǎo)化合物的廣闊來源．紅樹植物為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，通常生長(zhǎng)在鹽分高、氧氣缺乏的特殊生態(tài)環(huán)境中．因此，紅樹林植物及其內(nèi)生真菌為適應(yīng)這一特殊生境，形成特殊的生理特性和代謝途徑，已成為尋找新藥源的重要資源庫(kù)[1]．海洋微生物產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，類型多樣，尤其是許多具有較強(qiáng)生物學(xué)活性的小分子結(jié)構(gòu)，如大環(huán)內(nèi)酯類、生物堿類、肽類、萜類和醌類等，通過結(jié)構(gòu)修飾等可能成為藥物先導(dǎo)化合物的重要來源，而且其來源的特殊性，有利于解決可能的藥源問題，是目前海洋天然產(chǎn)物研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)．近年來，由于圍海養(yǎng)殖、圍海造地和砍伐等人為因素，中國(guó)紅樹林面積大為減少，許多珍貴紅樹樹種瀕臨滅絕．海南海桑(Sonneratiahainanensis)為海南特有紅樹樹種，僅分布于中國(guó)海南島．XING等[2]曾對(duì)海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的海南海桑內(nèi)生真菌多樣性及其種群的組織分布進(jìn)行了研究；亦有研究者從海南海桑同屬紅樹植物無瓣海桑、杯萼海桑和海桑內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了眾多結(jié)構(gòu)新穎的化合物[3-8]．本課題組對(duì)海南特有紅樹植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的活性分子[9-17]，近期又從海南海桑葉片中分離得到一株內(nèi)生淡色生赤殼菌Bionectriaochroleuca， 從其次生代謝產(chǎn)物中也鑒定出了具有抗細(xì)菌抗真菌抗腫瘤活性的成分[18]．本研究分析一株海南海桑葉片內(nèi)生曲霉菌Aspergillussp. HS02的化學(xué)成分，利用多種柱色譜技術(shù)從其發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物中分離純化得到一個(gè)化合物1(圖1)．根據(jù)高分辨質(zhì)譜、一維和二維核磁共振波譜技術(shù)，將其結(jié)構(gòu)鑒定為一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的吲哚生物堿，命名為quinadoline C．同時(shí)利用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)其抗農(nóng)業(yè)病原真菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)．

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of compound 1

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高分辨電噴霧質(zhì)譜(high resolution electrospray ionization mass spectroscopy, HRESIMS)數(shù)據(jù)由6210 TOF LC-MS質(zhì)譜儀(Agilent，美國(guó))測(cè)定；化合物的一維譜包括氫(1H)核磁共振譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)、核磁共振碳譜(13C-NMR)和二維譜包括異核單量子相關(guān)(heteronuclear single quantum correlation, HSQC)、異核多鍵相關(guān)(heteronuclear multiple bond correlation, HMBC)和氫-氫質(zhì)子同核相關(guān)譜(1H-1H correlated spectroscopy,1H-1HCOSY)數(shù)據(jù)在德國(guó)Bruker公司Bruker DRX-600核磁共振波譜儀測(cè)定，以四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移以δ表示；分析型薄層層析硅膠(GF254)和層析柱硅膠(200～300 μm)均購(gòu)自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20和ODS反相硅膠分別購(gòu)自瑞典Pharmacia Biotech和日本京都Nacalai Tesque公司；實(shí)驗(yàn)中使用的試劑均為分析純．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵

曲霉菌菌株Aspergillussp. HS02經(jīng)土豆培養(yǎng)基平板活化，28 ℃培養(yǎng)4 d后直接將菌塊接種于含有400 mL液體MEA(malt extract agar)培養(yǎng)基(麥芽提取物20 g/L、蔗糖20 g/L、蛋白胨1 g/L)的錐形瓶(1 000 mL)中，置于搖床120 r/min，28 ℃培養(yǎng)13 d．

1.2.2 化合物的分離和純化

發(fā)酵結(jié)束后，將上述發(fā)酵物用4層紗布過濾除去菌絲體得到約20 L發(fā)酵液，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取3遍，減壓濃縮得到3.2 g乙酸乙酯粗提物．該粗提物經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇梯度洗脫得7個(gè)流份(體積比分別為100∶ 0、100∶ 1、100∶ 2、100∶ 4、100∶ 8、100∶ 16和0∶ 100)．流份2(氯仿-甲醇，體積比為100∶ 1，420 mg)經(jīng)ODS反相硅膠柱層析，以甲醇-水(體積比分別為 40∶ 60、50∶ 50、60∶ 40、70∶ 30和100∶ 0)梯度洗脫得到5個(gè)流份，其中，第2個(gè)流份(甲醇-水體積比為50∶ 50)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(體積比為1∶ 1的氯仿-甲醇為流動(dòng)相)得到化合物1 (17.3 mg)．

1.2.3 抗農(nóng)業(yè)病原真菌活性測(cè)定

體外抗農(nóng)業(yè)病原真菌活性測(cè)定所采用的方法與文獻(xiàn)[9,19]報(bào)道的方法一致．采用PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基，對(duì)化合物1抗芒果炭疽病真菌和橡膠炭疽病真菌的活性進(jìn)行了測(cè)定，供試質(zhì)量濃度為10 mg/mL．

2 結(jié)果與討論

化合物1，灰白色粉末，正源高分辨電噴霧質(zhì)譜測(cè)其準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比m/z為526.207 0[M + Na]+，推出其分子式為C27H29N5O5([C27H29N5O5Na]+的計(jì)算值為526.206 6)， 計(jì)算其不飽和度為16．根據(jù)化合物1的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135譜可以看出該化合物具有11個(gè)季碳(碳化學(xué)位移δC分別為 175.9、171.7、161.3、152.0、147.8、139.7、139.1、121.8、85.6、75.5和65.2)、4個(gè)甲基(δC為26.3、25.2、18.2和14.8)、1個(gè)亞甲基(δC為42.9)和11個(gè)次甲基(δC為135.5、130.3、128.5、128.2、127.4、125.5、125.4、115.9、79.7、53.1和35.0)信號(hào)峰．其中，δC為161.3、171.7和175.9的季碳顯示該分子中有3個(gè)酰胺羰基存在，2個(gè)甲基(氫質(zhì)子化學(xué)位移δH分別為1.42和1.34)連接在季碳上，2個(gè)甲基(δH為1.31和1.08)連在次甲基上；在化合物的1H-NMR譜低場(chǎng)區(qū)有9個(gè)氫質(zhì)子信號(hào)(8.27, dd, 耦合常數(shù)J=7.8, 1.2 Hz; 8.04, 寬單峰(br s); 7.88, td,J=7.8, 1.2 Hz;δH=7.73, d,J=8.4 Hz; 7.60, td,J=7.8, 1.2 Hz; 7.43, d,J=7.8 Hz; 7.40, d,J=7.8 Hz; 7.32, td,J=7.8, 1.2 Hz; 7.09, td,J=7.8, 1.2 Hz)，其中1個(gè)為寬單峰，可能為酰胺鍵上的NH，另外8個(gè)芳香氫質(zhì)子位于兩個(gè)1,2-二取代苯環(huán)上；進(jìn)一步通過HSQC譜可判斷該化合物中還存在兩個(gè)羥基，綜合其氫譜和碳譜數(shù)據(jù)推斷該化合物上還存在一個(gè)NH．

分析該化合物的1H-1H COSY譜(圖2)中的相關(guān)信號(hào)可推斷該分子部分結(jié)構(gòu)片段：H-6與H-5和H-7存在相關(guān)，H-7與H-6和H-8存在相關(guān)，H-11與H2-12存在相關(guān)，H-19與H-18和H-20存在相關(guān)，H-20與H-19和H-21存在相關(guān)，H-23與H3-24和H3-25存在相關(guān)．進(jìn)一步分析其HMBC譜相關(guān)信號(hào)可揭示該分子的結(jié)構(gòu)：H-8與C-4和C-10存在相關(guān)，H-5和H-7與C-9存在相關(guān)，H-6和H-8與C-4存在相關(guān)；H3-25與C-2、C-23和C-24存在相關(guān)，H3-24與C-2、C-23和C-25存在相關(guān)，H-23與C-3、C-24和C-25存在相關(guān)，2-OH與C-2、C-3和C-23存在相關(guān)；1-NH與C-1、C-2、C-3和C-11存在相關(guān)，H-11與C-1、C-3、C-10和C-13存在相關(guān)，H-12與C-1、C-13、C-14和C-22存在相關(guān)，13-OH與C-12、C-13、C-14和C-22存在相關(guān)，H-14與C-12和C-13存在相關(guān)；H-21與C-13和C-17存在相關(guān)，H-18和H-20與C-22存在相關(guān)，H-19和H-21與C-17存在相關(guān)；上述結(jié)構(gòu)片段連接整理后即可推出化合物1的平面結(jié)構(gòu)，為新吲哚類生物堿．該化合物的結(jié)構(gòu)與一個(gè)已報(bào)道化合物quinadoline A[20]的結(jié)構(gòu)差別在于，化合物1上C-2與C-23的連接鍵為單鍵，C-2被羥基化．

依據(jù)該化合物的二維核磁實(shí)驗(yàn)包括HSQC、HMBC 和1H-1H COSY的結(jié)果，將其1H和13C-NMR數(shù)據(jù)歸屬如表1．

利用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法，體外測(cè)定了該化合物對(duì)芒果、橡膠炭疽病真菌的抑制活性，遺憾的是該化合物在較高測(cè)試濃度下亦對(duì)供試病原真菌無平板抑制活性．

結(jié) 語(yǔ)

生物堿具有多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中，吲哚類生物堿是迄今發(fā)現(xiàn)最多的一類．生物堿具有多樣的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗寄生蟲和鎮(zhèn)痛等．生物堿主要產(chǎn)生于植物，如長(zhǎng)春花中含有的抗癌單萜吲哚類、雙吲哚類生物堿，但在微生物也會(huì)大量產(chǎn)生，尤其是真菌，如麥角菌屬真菌產(chǎn)生的麥角堿類毒素．本研究對(duì)一株海南特有紅樹植物海南海桑葉片內(nèi)生曲霉菌Aspergillussp. HSO2的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，從其發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物中分離純化得到一個(gè)新吲哚生物堿quinadoline C，該化合物的結(jié)構(gòu)與已知吲哚生物堿quinadoline A相似，quinadoline A是KOYAMA等[20]從一株曲霉菌Aspergillussp. FKI-1746的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，同時(shí)還報(bào)道分離到另一個(gè)新吲哚生物堿quinadoline B．2016年，RAJACHAN等[21]從土壤真菌NeosartoryaspinosaKKU-1NK1的菌絲體中也分離得到quinadoline A．quinadoline A和B對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中的脂滴合成具有較強(qiáng)的劑量依賴型抑制活性，表明該類化合物具有降脂或降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用，因此該類化合物可能具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景．

表1 化合物1的1H 譜(600 MHz)和 13C譜(150 MHz)核磁共振數(shù)據(jù)(測(cè)試溶劑為氘代丙酮)