被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠心肌組織 心室結(jié)構(gòu)及血清標(biāo)志物的影響*

趙佳　江鳳　夏紀(jì)筑　蔣松辰　王文淵

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 四川 瀘州 646000)

吸煙是人類(lèi)健康的致命殺手。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，截至2015年，全球吸煙人數(shù)達(dá)10億，全球十分之一的死亡與吸煙有關(guān)[1]。而在我國(guó)，現(xiàn)有吸煙人數(shù)已超過(guò)3億，同時(shí)有7.4億非吸煙者遭受被動(dòng)吸煙的危害，每年死于吸煙相關(guān)疾病的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)[2]。目前有臨床研究顯示，吸煙與低濃度的超敏肌鈣蛋白增加相關(guān)，表明煙草煙霧中的物質(zhì)可能損傷心肌細(xì)胞[3]。同時(shí)Wilson等[4]在對(duì)社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)(Atherosclerosis Risk in Communties，ARIC)研究中對(duì)數(shù)千名參與者的心臟及其功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)吸煙與心室壁變厚及心臟泵血能力下降存在關(guān)聯(lián)，這兩個(gè)因素與心衰風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。本研究通過(guò)觀察被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠心肌及血清標(biāo)志物的影響，探討被動(dòng)吸煙對(duì)心臟的危害。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料清潔級(jí)健康雄性SD大鼠20只，購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房；天下秀牌香煙(焦油量：10mg，煙氣煙堿量：1.0mg，煙氣一氧化碳量：11mg，過(guò)濾嘴卷煙)由四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品；腦鈉肽(BNP)、大鼠肌鈣蛋白T(Tn-T)Elasa試劑盒購(gòu)于武漢拜意爾生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組7周齡SD雄性大鼠20只，體重(200±20)g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：實(shí)驗(yàn)組10只，對(duì)照組10只。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1被動(dòng)吸煙將大鼠裝入自制玻璃裝置給予被動(dòng)吸煙，該裝置大小為60cm×50cm×50cm，頂部開(kāi)有數(shù)個(gè)1cm×1cm通氣口。每天2次，兩次間隔6h，每次共燃燒10只煙，持續(xù)1h(箱內(nèi)放置無(wú)水氯化鈣吸收水蒸氣，將2支香煙點(diǎn)燃形成煙霧，并保持均勻，煙霧暴露過(guò)程中箱內(nèi)氧濃度維持在20%)，每周5d，共持續(xù)12周。對(duì)照組予以正?？諝鈱?duì)照。

1.3.2飼養(yǎng)及取材方法兩組大鼠采用同等方式飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)動(dòng)物房，日夜交替。供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料(購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)和自來(lái)水，自由取食水。于4、8、12周時(shí)禁食8h后稱重，8、12周時(shí)麻醉(1%苯巴比妥 40mg/kg)后行小動(dòng)物心臟彩超，12周時(shí)心臟彩超后取血及心臟，心臟經(jīng)甲醛固定，包埋，行心肌HE染色，血4℃ 2000r離心10min后收集上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，檢測(cè)大鼠血清BNP及Tn-T。

1.3.3心臟彩超檢查心室結(jié)構(gòu)大鼠麻醉后固定，應(yīng)用心臟彩超(VIVID，GE E9 Vingmed ultrasound)探頭頻率12MHz,取胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲運(yùn)動(dòng)曲線后，分別測(cè)量大鼠左心室舒張末期容積(LVIDd)、左室收縮末期容積(LVIDs)、舒張期室間隔厚度(IVSD)、收縮期室間隔厚度(IVSS)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。各指標(biāo)在連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期上測(cè)量后取其平均值。

1.3.4血清BNP及Tn-T測(cè)定具體操作參照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)。BNP:在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各50μl,立即加入50μl生物素化抗體工作液，37℃孵育45min后洗滌3次，再加入100μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min，洗滌5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl終止液，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，計(jì)算出BNP含量。Tn-T：在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100μl，立即加入100μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60min后洗滌3次，再加入100μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min，洗滌5次，加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右，加入50μl終止液，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，計(jì)算出Tn-T含量。

1.3.5HE染色取大鼠心臟，心肌經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋,切片，常規(guī)脫蠟至水，先后經(jīng)蘇木素-伊紅染色，梯度酒精常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片等步驟。采用光學(xué)顯微鏡拍照，觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)的改變。

2　結(jié)果

2.1被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠體重的影響與對(duì)照組相比，在第8周和第12周時(shí)被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠體重有顯著地抑制作用(P=0.006<0.01或P=0.015<0.05)，但在4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠的體重?zé)o差異(P=0.098)，見(jiàn)表1。

表1　兩組大鼠體重比較Table 1　Comparison of body weight between the two groups

注：與對(duì)照組相比，①<0.05，②P<0.01

2.2被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠心室結(jié)構(gòu)的影響與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠在第12周時(shí)具有更大經(jīng)體重調(diào)整后的左室舒張末期容積(P=0.033<0.05)、收縮末期容積(P=0.022<0.05)及室間隔厚度(P=0.016<0.05或P=0.048<0.05)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，被動(dòng)吸煙組大鼠的左室舒張末期容積增加(P=0.047<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3被動(dòng)吸煙對(duì)血清標(biāo)志物(BNP及Tn-T)的影響與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清BNP及Tn-T濃度明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表3。

2.4被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠心肌的影響對(duì)照組大鼠心肌結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰，核居中，間質(zhì)為少量血管及結(jié)締組織，見(jiàn)圖1A；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心室肌細(xì)胞纖維分離及纖維部分?jǐn)嗔?，血管淋巴?xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)含大量紅細(xì)胞，見(jiàn)圖1B～D。

表2　不同時(shí)間兩組大鼠心室結(jié)構(gòu)比較Table 2　Comparison of echocardiographic study between the two groups

注：IVSD：舒張期室間隔厚度；IVSS：收縮期室間隔厚度；LVIDd：左室舒張末期容積；LVIDs：左室收縮末期容積；BW：體重；EF：左室射血分?jǐn)?shù)；FS：左室短軸縮短率。與對(duì)照組相比，①P<0.05，與不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組相比，②P<0.05

Table3ComparisonofBNPandTn-Tinsecrumbetweenthetwogroups

指標(biāo)　對(duì)照組　實(shí)驗(yàn)組BNP(pg/ml)70.096±4.392106.198±8.453Tn-T(pg/ml)99.414±9.201①156.570±5.341①

注：BNP正常值：<80ng/ml；Tn-T正常值：<110pg/ml。與對(duì)照組相比，①P<0.001

3　討論

圖1　兩組大鼠心肌的比較Figure 1　Comparison of biochemical histopathological studies between the two groups

吸煙會(huì)引起急慢性疾病，最先被熟知的是其與肺部腫瘤的關(guān)系。直到19世紀(jì)60年代，其與心血管疾病的關(guān)系仍具爭(zhēng)議。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是心血管疾病的危險(xiǎn)因子。最早研究認(rèn)為，香煙中的活性物質(zhì)-尼古丁對(duì)交感神經(jīng)系統(tǒng)有刺激作用，通過(guò)增加血壓、心率以及心搏量影響心血管系統(tǒng)；還認(rèn)為吸煙通過(guò)血管舒縮障礙、凝血活性異常、血小板激活、白細(xì)胞活化、脂質(zhì)過(guò)氧化以及平滑肌增殖導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加炎癥及栓塞風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。近年有臨床研究顯示，吸煙與低濃度的超敏肌鈣蛋白增加相關(guān)，表明煙草煙霧中的活性物質(zhì)可能損傷心肌細(xì)胞[3]；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙與心室壁變厚及心臟泵血能力下降相關(guān)[6]，這兩個(gè)因素與心衰風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠體重在4周時(shí)無(wú)明顯差異(P>0.05)，但在8周及12周時(shí)有明顯的差異(P<0.05)，提示被動(dòng)吸煙可能影響大鼠的生長(zhǎng)；且隨時(shí)間的增加，影響越明顯。這與梁會(huì)鵬等[7]研究結(jié)果一致。對(duì)于被動(dòng)吸煙影響體重的具體機(jī)制尚不明確，可能與以下因素相關(guān)：①香煙燃燒過(guò)程中氧氣減少，煙霧中CO與血液中的血紅蛋白結(jié)合，導(dǎo)致機(jī)體缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致食欲降低。②煙霧中的尼古丁增加交感神經(jīng)活性，促進(jìn)兒茶酚胺釋放，增加基礎(chǔ)代謝率。有研究表明，尼古丁會(huì)通過(guò)興奮交感神經(jīng)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素與生長(zhǎng)激素增加，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而影響代謝，而不是通過(guò)影響胰島素分泌[8]，但是這一結(jié)論還存在爭(zhēng)議。Moustafa等[9]研究結(jié)果顯示，吸煙組大鼠與非吸煙組大鼠體重沒(méi)有明顯的變化，這可能是該研究觀察時(shí)間較短，持續(xù)時(shí)間僅1個(gè)月，而本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間持續(xù)3個(gè)月。

通過(guò)對(duì)大鼠心臟彩超進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，8周時(shí)兩組大鼠心臟結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯改變。而在12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組具有更大的經(jīng)體重調(diào)整后的心室收縮末期容積及舒張末期容積(P<0.05)，這與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)論相同[10-11]。不同的是，本研究時(shí)間較Castardeli短，同時(shí)還得出被動(dòng)吸煙12周，經(jīng)體重調(diào)整后的被動(dòng)吸煙組大鼠具有更大的室間隔厚度(P<0.05)，雖未能發(fā)現(xiàn)其他指標(biāo)(如EF及FS等)出現(xiàn)明顯改變，但發(fā)現(xiàn)隨被動(dòng)吸煙時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠左室舒張末期容積增加(P<0.05)，這表明被動(dòng)吸煙會(huì)影響心室重塑的過(guò)程。心功能進(jìn)行性降低是心室重塑的顯著特點(diǎn)，同時(shí)心室結(jié)構(gòu)改變會(huì)促進(jìn)心功能障礙[12-13]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)心功能降低，可能是因?yàn)樵缙诘募?xì)胞生長(zhǎng)及重塑有助于維持心功能。我們?cè)谶M(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)吸煙4個(gè)月后大鼠室間膈及室壁厚度在肉眼觀上已經(jīng)明顯比正常大鼠肥厚，但不足的是未行心臟彩超檢查。

本研究發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)吸煙組大鼠血清BNP濃度較正?？諝鈱?duì)照組增加,提示煙草煙霧中的物質(zhì)促進(jìn)了BNP分泌或抑制了BNP清除。促進(jìn)BNP分泌的可能機(jī)制為長(zhǎng)期香煙煙霧暴露導(dǎo)致機(jī)體血壓升高，增加心室壓力負(fù)荷，導(dǎo)致心室分泌BNP增加；同時(shí)較高的血壓對(duì)血管壁存在剪切力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)BNP的釋放。Talukder等[14]研究證實(shí)，煙草煙霧暴露刺激了交感神經(jīng)系統(tǒng)，增加了兒茶酚胺濃度，導(dǎo)致血壓升高。該研究還證實(shí)其能增加氧化應(yīng)激及降低NO生物利用度，引起內(nèi)皮功能障礙及心室重構(gòu)。而目前尚無(wú)探討香煙煙霧暴露是否抑制BNP清除的研究。被動(dòng)吸煙組大鼠血清TnT濃度較正?？諝鈱?duì)照組增加，提示香煙煙霧導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制是煙草燃燒后產(chǎn)生的污染物增加了氧化應(yīng)激和產(chǎn)生過(guò)度的自由基，故推測(cè)可能是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的炎癥因子及過(guò)度的自由基導(dǎo)致了心肌細(xì)胞損傷[15]。Ambrose等[16]研究表明，香煙煙霧導(dǎo)致氧化應(yīng)激表現(xiàn)為炎癥和栓子形成，機(jī)制是通過(guò)血管舒縮障礙、促凝過(guò)程、血小板激活、白細(xì)胞活化和平滑肌增殖而實(shí)現(xiàn)的。

本研究對(duì)大鼠心肌病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)吸煙會(huì)引起心室肌細(xì)胞纖維分離及纖維的部分?jǐn)嗔眩芰馨图?xì)胞浸潤(rùn)及血管內(nèi)充血，這與文獻(xiàn)報(bào)道符合[17]。Hariri等[18]研究發(fā)現(xiàn)，于香煙煙霧暴露1個(gè)月后出現(xiàn)心肌肥厚、炎癥、纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈鈣化的改變，本研究也得到了部分結(jié)論。該研究還發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激的程度與冠脈疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，并導(dǎo)致血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的進(jìn)展。Talukder等[14]研究表明，繼發(fā)于吸煙的高血壓、心臟肥大和重塑的原因是心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的增加；吸煙會(huì)導(dǎo)致心室細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，如心肌細(xì)胞線粒體損傷、部分破壞或者消失，從而影響Z線[17]。本研究發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)的改變，推測(cè)其機(jī)制可能是通過(guò)香煙燃燒產(chǎn)生的有毒物質(zhì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激及過(guò)度的自由基損傷心肌細(xì)胞；同時(shí)血壓升高引起血管內(nèi)皮損傷及增加壓力負(fù)荷，導(dǎo)致BNP及肌鈣蛋白的改變。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期被動(dòng)吸煙會(huì)導(dǎo)致心肌組織、心室結(jié)構(gòu)改變及影響血清標(biāo)志物濃度，影響心室重塑。而因?yàn)闊煵萑紵a(chǎn)生的煙霧中許多有毒的成分已被證明可以引起炎癥、過(guò)敏、窒息、癌變，如尼古丁、焦油、苯、甲醛、苯并芘、一氧化碳、氰化物及丙烯醛等，所以本研究存在局限性，特別是由于方法學(xué)原因，所采取被動(dòng)吸煙方式引發(fā)造成大鼠的心肌組織、心臟功能及損傷標(biāo)志物的變化因素較多，可能為上述有害成分的綜合作用結(jié)果。所以，下一步研究可進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)、分子結(jié)構(gòu)方面探討其毒理學(xué)機(jī)制。