不對(duì)稱和對(duì)稱二甲基精氨酸與川崎病冠狀動(dòng)脈病變相關(guān)性分析

李顯東　呂軍　胡秀學(xué)

[摘要] 目的 研究L-精氨酸、不對(duì)稱二甲基精氨酸（ADMA）和對(duì)稱性二甲基精氨酸（SDMA）3種生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)川崎?。↘D）患兒的預(yù)后。 方法 選取2012年1月～2013年12月湖北省十堰市太和醫(yī)院兒科住院的典型KD患兒39例作為病例組，采集靜脈血，同時(shí)收集與之年齡相匹配的呼吸道感染伴有發(fā)熱并排除了心肌受累患兒27例的靜脈血漿作為對(duì)照組，測(cè)量病例組和對(duì)照組中L-精氨酸、ADMA和SDMA的血漿水平。 結(jié)果 靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）治療前病例組KD1患兒的血漿L-精氨酸、ADMA和SDMA水平均低于對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01）。IVIG治療后病例組不同治療時(shí)間患兒的L-精氨酸、ADMA、L-精氨酸/ADMA比率（AAR）和精氨酸甲基化綜合指數(shù)（AMI）比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。病例組KD1、病例組KD2、病例組KD3、病例組KD4患兒血漿SDMA水平均低于對(duì)照組（P < 0.01），但I(xiàn)VIG治療前后的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；病例組KD2、病例組KD3和病例組KD4患兒的AMDA/SMDA比率（ASR）均高于對(duì)照組與病例組KD1患兒（P < 0.01）。在病例組KD1患兒中，冠脈擴(kuò)張患兒L-精氨酸水平高于無冠脈擴(kuò)張患兒（P < 0.01）；在病例組KD2患兒及病例組KD3患兒中，冠脈擴(kuò)張患兒L-精氨酸水平均低于無冠脈擴(kuò)張患兒（P < 0.01）。 結(jié)論 L-精氨酸、ADMA和SDMA的水平可能與KD有關(guān)。低水平L-精氨酸及IVIG治療后ASR與冠狀動(dòng)脈異常的KD患兒有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 不對(duì)稱二甲基精氨酸；對(duì)稱性二甲基精氨酸；川崎??；L-精氨酸

[中圖分類號(hào)] R5414.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）04（b）-0063-04

[Abstract] Objective To study the three biomarkers of L-arginine， asymmetric dimethylarginine （ADMA） and symmetric dimethylarginine （SDMA） are used to predict the prognosis of children patients with kawasaki disease （KD）. Methods From January 2012 to December 2013， 39 children with KD in Department of Pediatric in Taihe Hospital were selected as the case group， venous blood was collected， and at the same time， the plasma of 27 children patients matched with age was collected as control group， which of respiratory infection was accompanied by fever and exclusion of involvement of myocardium. The plasma levels of L-arginine， ADMA and SDMA were measured in the case group and control group. Results The plasma levels of L-arginine， ADMA and SDMA before intravenous immunoglobulin （IVIG） treatment of children in the case group KD1 were lower than those of control group （P < 0.05 or P < 0.01）. After IVIG treatment， the L-arginine， ADMA， L-arginine/ADMA ratio （AAR） and arginine methylation composite index （AMI） of different treatment time in case group were compared， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The plasma levels of SDMA of children in case group KD1， case group KD2， case group KD3， case group KD4 were all lower than the control group （P < 0.01）， but comparison of before and after IVIG treatment， the difference were not statistically significant （P > 0.05）. The AMDA/SMDA ratio （ASR） of children in case group KD2， case group KD3， case group KD4 were all higher than control group and case group KD1 （P < 0.01）. In the case group KD1， the L-arginine level of children with coronary artery dilation was higher than that in children without coronary artery dilatation （P < 0.01）， while in the case group KD2 and the case group KD3， the children patients with coronary artery dilation was lower than that in children without coronary artery dilatation （P < 0.01）. Conclusion The levels of L-arginine， ADMA and SDMA may be related to KD. Low level of L-arginine and ASR of after IVIG treatment are associated with children patients with abnormal coronary artery KD.

[Key words] Asymmetric dimethylarginine； Symmetric dimethylarginine； Kawasaki diseas； L- arginine

川崎病（kawasaki disease，KD）是一種以全身血管炎變?yōu)橹饕±淼募毙园l(fā)熱性出疹性小兒疾病[1]。1967年日本川崎富作醫(yī)生首次報(bào)道，本病可發(fā)生嚴(yán)重心血管病變，如動(dòng)脈瘤、心肌炎、缺血性心臟病等而致死[2]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮功能障礙（ED）是KD重要的病理基礎(chǔ)[3]。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮（nitric oxide，NO）作用于平滑肌細(xì)胞從而擴(kuò)張血管，NO缺乏對(duì)ED疾病發(fā)生發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)急性KD患兒NO代謝物NOx（亞硝酸鹽+硝酸鹽）濃度增加，血漿硝酸鹽濃度在KD急性期和亞急性期增加[4]。不對(duì)稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一氧化氮合酶（NOS）的內(nèi)源性抑制劑，ADMA通過與NOS的底物L(fēng)-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)，抑制NO生成[5-6]。因此，血漿L-精氨酸/ADMA比率（AAR）可作為NO生物利用度的指標(biāo)[6]。研究表明，ADMA/對(duì)稱二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）的比例可作為二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（DDAH）的活性的間接指標(biāo)，有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)制[7]。本研究通過分析精氨酸甲基化綜合指數(shù)[AMI=L-精氨酸/（ADMA+SDMA）]來闡明在KD的不同階段是否有差異?，F(xiàn)將報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月～2013年12月湖北省十堰市太和醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）兒科住院并符合2002年日本制訂的典型KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-9]的患兒39例為病例組，采集靜脈血，同時(shí)收集與之年齡相匹配的呼吸道感染伴有發(fā)熱并排除了心肌受累患兒27例（患有上呼吸道感染和/或下呼吸道感染的患兒，包括急性咽炎，急性扁桃體炎，急性支氣管炎，急性細(xì)支氣管炎和咳嗽）的靜脈血漿作為對(duì)照組。病例組男29例，女10例；年齡1～6歲，平均（1.78±0.2）歲。對(duì)照組男18例，女9例；年齡1～7歲，平均（2.01±0.32）歲。兩組患兒性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有患有KD的患兒均在我院接受靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治療?；純菏紫扔脝蝿┝康腎VIG（廣東雙林生物制藥有限公司，批號(hào)：S20003024）治療12 h，劑量為2 g/kg。阿司匹林（山西蘭花七佛山制藥有限公司，批號(hào)：H14023980）以3～5 mg/kg的劑量單次給藥，并持續(xù)至所有炎癥消失為止[10-11]。IVIG治療前采集外周血樣（為病例組KD1患兒），應(yīng)用IVIG治療3 d內(nèi)作為急性期樣本（為病例組KD2患兒），IVIG治療后3周為亞急性期樣本（為病例組KD3患兒），6～12個(gè)月作為慢性期樣本（為病例組KD4患兒）。定義冠脈擴(kuò)張（CAL）標(biāo)準(zhǔn)為冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑至少為3 mm（如果受試者年齡5歲以上則為4 mm）或某段內(nèi)徑至少為超聲心動(dòng)圖相鄰段的1.5倍[1，12]。病例組共有15例患兒有冠脈擴(kuò)張，24例患兒無冠脈擴(kuò)張。所有患兒均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核。

1.2 方法

使用高效液相色譜HP系列1100（購(gòu)自安捷倫科技公司）及鄰苯二甲醛-3-巰基丙酸衍生化試劑測(cè)定血漿L-精氨酸、ADMA和SDMA水平[13]。100 μL血漿與4 μL 20 μmol/L L-精氨酸作為內(nèi)標(biāo)（Fluka，德國(guó)），350 μL 0.4 μmol/L硼酸鹽緩沖液（pH 9）充分混勻，在Oasis MCX陽(yáng)離子交換SPE柱（Waters，德國(guó)）上進(jìn)行分離，洗滌用1 mL硼酸鹽緩沖液洗滌1次，H2O每次1 mL沖洗3次，1 mL甲醇沖洗1次。用1 mL NH4OH/H2O/甲醇（10∶40∶50）混合洗脫液將樣品洗脫，然后用60 μL的H2O復(fù)溶?；厥章始s為90%。將60 μL樣品加入Agilent SB-C18柱（14～150 mm； Agilent Technologies，Inc）。流速1.2 mL/min，并在EX338：EM455測(cè)量熒光強(qiáng)度。L-精氨酸、ADMA和SDMA的標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍各自為1～100、0.5～5和0.5～5 μmol/L。L-精氨酸、ADMA、SDMA的變異系數(shù)分別為4.1%、3.2%和5.9%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與治療前后病例組患兒L-精氨酸、ADMA、SDMA指標(biāo)比較

病例組KD1患兒L-精氨酸血漿水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；病例組KD2患兒L-精氨酸血漿水平均高于對(duì)照組與病例組KD1患兒（P < 0.01）；病例組KD3患兒L-精氨酸血漿水平高于病例組KD1患兒（P < 0.01），但低病例組KD2患兒（P < 0.01）；病例組KD4患兒L-精氨酸血漿水平低于病例組KD2患兒（P < 0.01）。病例組KD1患兒ADMA血漿水平低于對(duì)照組（P < 0.01）；病例組KD2、病例組KD3、病例組KD4患兒ADMA水平均高于病例組KD1患兒（P < 0.01）；病例組KD4患兒ADMA血漿水平低于病例組KD3患兒（P < 0.01）。病例組KD1、病例組KD2、病例組KD3、病例組KD4患兒血漿SDMA水平均低于對(duì)照組（P < 0.01），但I(xiàn)VIG治療前后的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 對(duì)照組與治療前后病例組患兒AAR、AMDA/SMDA比率（ASR）、AMI比較

病例組KD1患兒AAR、ASR和AMI與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；病例組KD2患兒AAR、ASR和AMI與對(duì)照組及病例組KD1患兒比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；病例組KD3患兒與KD4患兒的AAR、AMI均低于病例組KD2患兒（P < 0.01）；病例組KD2、KD3和KD4患兒的ASR均高于對(duì)照組與病例組KD1患兒（P < 0.01）。見表2。

2.3 冠狀動(dòng)脈擴(kuò)展和無冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張患兒各指標(biāo)比較

將15例有冠脈擴(kuò)張和24例無冠脈擴(kuò)張的患兒在各自組內(nèi)進(jìn)行ADMA、SDMA、AAR、ASR和AMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；在病例組KD1患兒中，冠脈擴(kuò)張患兒L-精氨酸水平高于無冠脈擴(kuò)張患兒（P < 0.01）；在病例組KD2患兒及病例組KD3患兒中，冠脈擴(kuò)張患兒L-精氨酸水平均低于無冠脈擴(kuò)張患兒（P < 0.01）。見表3。

3 討論

本研究結(jié)果提示，病例組KD1患兒L-精氨酸血漿水平低于對(duì)照組（P < 0.05），IVIG治療后L-精氨酸水平升高（P < 0.01）。一個(gè)可能的原因是KD患兒L-精氨酸從血漿進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞合成NO，另一個(gè)可能的原因是血漿L-精氨酸水平的降低與全身性炎癥直接相關(guān)。事實(shí)上，炎癥過程通過增加精氨酸酶活性來降低L-精氨酸水平，該酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥氨酸，并且通過γ+轉(zhuǎn)運(yùn)體系介導(dǎo)L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞中從而導(dǎo)致L-精氨酸減少[14]。

ADMA由精氨酸殘基通過蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化產(chǎn)生，然后蛋白水解，通過DDAH降解來清除等離子體[15]。病例組KD1患兒ADMA血漿水平低于對(duì)照組（P < 0.01），這與Straface等[16]結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)ADMA在NOS抑制劑中具有重要的作用，NOS通過形成活性氮使NO具有細(xì)胞毒性，并增加心血管風(fēng)險(xiǎn)[17]。

SDMA能夠抑制細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸攝取及腎小管吸收精氨酸[18-20]。本研究提示病例組KD1患兒、病例組KD2患兒、病例組KD3患兒、病例組KD4患兒血漿SDMA水平均低于對(duì)照組（P < 0.01），并且IVIG治療前后的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。這一發(fā)現(xiàn)可能意味著KD患兒腎臟清除SDMA增加，通過蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生減少，或增加其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞或組織。而且，持續(xù)血漿SDMA低水平提示KD患兒有較高的NO生物利用度，并且急性KD患兒在急性期和亞急性期血漿硝酸鹽濃度增加。此外，高ASR具有低DDAH活動(dòng)。本研究中KD患兒血漿SDMA水平持續(xù)降低提示NO生物利用度較低。

本研究具有一定的局限性。首先是樣本量較少，其次是很多常規(guī)食用的食物中含有較多的精氨酸[19]，這可能對(duì)本研究有一定的影響。因此，需要進(jìn)一步檢測(cè)消耗較少量精氨酸（如紅肉、海鮮、雞蛋和堅(jiān)果等）的KD患兒的各項(xiàng)指標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kuo HC，Wang CL，Liang CD，et al. Association of lower eosinophil-related T helper 2（Th2）cytokines with coronary artery lesions in Kawasaki disease [J]. Pediatr Allergy Immunol，2009，20（3）：266-272.

[2] Yamakawa R，Ishii M，Sugimura T，et al. Coronary endothelial dysfunction after Kawasaki disease：evaluation by intracoronary injection of acetylcholine [J]. J Am Coll Cardiol，1998，31（5）：1074-1080.

[3] Tain YL，F(xiàn)reshour G，Dikalova A，et al. Vitamin E reduces glomerulosclerosis，restores renal neuronal NOS，and suppresses oxidative stress in the 5/6 nephrectomized rat [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2007，292（5）：F1404.

[4] Wang CL，Wu YT，Lee CJ，et al. Decreased nitric oxide production after intravenous immunoglobulin treatment in patients with Kawasaki disease [J]. J Pediatr，2002，141（4）：560-565.

[5] Teerlink T，Luo Z，Palm F，et al. Cellular ADMA：regulation and action [J]. Pharmacol Res，2009，60（6）：448-460.

[6] Tain YL，Huang LT. Asymmetric dimethylarginine：clinical applications in pediatric medicine [J]. J Formos Med Assoc，2011，110（2）：70.

[7] B？觟ger RH. The emerging role of asymmetric dimethylarginine as a novel cardiovascular risk factor [J]. Cardiovasc Res，2003，59（4）：824-833.

[8] Newburger JW，Takahashi M，Gerber MA，et al. Diagnosis，treatment，and long-term management of Kawasaki disease：a statement for health professionals from the committee on rheumatic fever，endocarditis and Kawasaki disease，council on cardiovascular disease in the young，Ame？鄄rican heart association [J]. Circulation，2004，110（17）：2747-2771.

[9] 黃錚.美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)（AHA）川崎病診斷指南[J].嶺南心血管病雜志，2003，（4）：301.

[10] Matsubara T，Mason W，Kashani IA，et al. Gastrointestinal hemorrhage complicating aspirin therapy in acute Kawasaki disease [J]. J Pediatr，1996，28（5）：701-703.

[11] Xie T，Wang Y，F(xiàn)u S，et al. Predictors for intravenous immunoglobulin resistance and coronary artery lesions in Kawasaki disease [J]. Pediatr Rheumatol Online J，2017，15（1）：17.

[12] Kuo HC，Yang KD，Liang CD，et al. The relationship of eosinophilia to intravenous immunoglobulin treatment failure in Kawasaki disease [J]. Pediatr Allergy Immunol，2007，18（4）：354-359.

[13] Huang LT，Chen CC，Sheen JM，et al. The interaction between high ammonia diet and bile duct ligation in developing rats：assessment by spatial memory and asymmetric dimethylarginine [J]. Int J Dev Neurosci，2010，28（2）：169-174.

[14] Oakley F，Trim N，Constandinou CM，et al. Hepatocytes express nerve growth factor during liver injury：evidence for paracrine regulation of hepatic stellate cell apoptosis [J]. Am J Pathol，2003，163（5）：1849-1858.

[15] Bouras G，Deftereos S，Tousoulis D，et al. Asymmetric Dim？鄄ethylarginine（ADMA）：a promising biomarker for cardio？鄄vascular disease [J]. Curr Top Med Chem，2013，13（2）：180-200.

[16] Straface E，Gambardella L，Metere A，et al. Oxidative stress and defective platelet apoptosis in na？觙ve patients with Kawasaki disease [J]. Biochem Biophys Res Commun，2010， 392（3）：426-430.

[17] Eleuteri E，Magno F，Gnemmi I，et al. Role of oxidative and nitrosative stress biomarkers in chronic heart failure [J]. Front Biosci（Landmark Ed），2009，14：2230.

[18] Tojo A，Welch WJ，Bremer V，et al. Colocalization of deme？鄄thylating enzymes and NOS and functional effects of methylarginines in rat kidney [J]. Kidney Int，1997，52（6）：1593-1601.

[19] Ikemoto Y，Teraguchi M，Ono A，et al. Serial changes of plasma nitrate in the acute phase of Kawasaki disease [J]. Pediatr Int，2003，45（4）：421-425.

[20] Dhillon R，Clarkson P，Donald AE，et al. Endothelial dysfunction late after Kawasaki disease [J]. Circulation，1996， 94（9）：2103-2106.

（收稿日期：2017-11-23 本文編輯：萬 平）