免疫親和柱凈化-HPLC-FLD法測(cè)定天麻藥材中黃曲霉毒素的含量

張玉蓮　宋　嬿　鄭希望

（上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，上海200001）

0　引言

黃曲霉毒素是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是由黃曲霉（aspergillus flavus）、寄生曲霉（a.parasiticus）產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它們存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類(lèi)健康危害極為突出的一類(lèi)霉菌毒素。1993年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類(lèi)致癌物。

目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有二十余種，主要的有B1、B2、G1、G2四種，其中毒性最強(qiáng)的為B1。

天麻（Gastrodiae rhizome）來(lái)源于蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，其具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，是名貴中藥材。研究并建立天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的測(cè)定方法，可以為天麻藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)與控制提供依據(jù)。

本研究采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜（HPLC）-熒光光度檢測(cè)（FLD）法，測(cè)定天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

1　材料與儀器

1.1　材料

1.1.1天麻藥材

天麻藥材均從各產(chǎn)地直接購(gòu)買(mǎi)，并經(jīng)上海市中藥行業(yè)專(zhuān)家張?jiān)隽祭蠋熻b定為天麻Gastrodiae rhizoma。

1.1.2主要試劑

乙腈、甲醇（色譜級(jí)），購(gòu)自德國(guó)默克公司；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）、碘（分析純）、吐溫-20，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑公司；免疫親和柱，購(gòu)自美國(guó)Beacon公司；黃曲霉毒素混合對(duì)照品（98%），購(gòu)自上海安譜公司；PBS緩沖液，購(gòu)自德國(guó)GE公司；親水性PTFE微孔濾膜（25 mm×0.45μm），購(gòu)自上海駟虎科技公司。

1.2　儀器

1.2.1儀器配置

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（配套FLD檢測(cè)器），安捷倫公司；Pickering Vector柱后衍生化儀，美國(guó)Pickering公司；METTLER TOLEDO XS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Anke TDL-5000B離心機(jī)，上海安亭公司；Milli-Q Reference純水機(jī)，密理博公司。

1.2.2色譜條件

色譜柱：安捷倫Poroshell EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇:乙腈:水=18:18:62；流速：1 mL/min。

FLD檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，PMTGAIN值15；相鄰兩個(gè)峰的分離度應(yīng)大于1.5。

柱溫35℃的柱后衍生化法：衍生溶液為0.05%的碘溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100 mL使其溶解，用水稀釋至1 000 mL），衍生化泵流速0.3 mL/min，衍生化溫度70℃。

進(jìn)樣量：20μL。

2　方法

2.1　標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的標(biāo)示濃度分別為1.0 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL，純度均為98%）1 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液；精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置于5 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2　供試品溶液的制備

精密稱(chēng)定天麻藥材粉末2 g，置于50 mL離心管中，加入50%乙腈水溶液30 mL，用手持勻漿機(jī)高速攪拌2 min，加入氯化鈉2.5 g，振搖或渦旋至溶液分層，離心5 min（離心速度4 000 r/min）；精密量取上清液6 mL，置于50 mL離心管中，加含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液40 mL，搖勻，全部轉(zhuǎn)移至免疫親和柱（以少量緩沖液多次潤(rùn)洗離心管，并轉(zhuǎn)移至免疫親和柱），流速3 mL/min，用20 mL水洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子將水?dāng)D出，加入甲醇1.4 mL洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3　測(cè)定方法

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣體積分別為1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.2樣品測(cè)定

取20μL供試品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。

2.4　方法學(xué)考察

2.4.1線(xiàn)性關(guān)系考察

按照2.3的測(cè)定方法，對(duì)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)量值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立回歸曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸系數(shù)。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相關(guān)系數(shù)及回歸方程如表1所示。

2.4.2加標(biāo)回收率考察

精密稱(chēng)定天麻藥材粉末2 g，置于50 mL離心管中，精密加入0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，混勻，3個(gè)不同濃度的儲(chǔ)備溶液每個(gè)平行制備3份，再精密加入50%乙腈30 mL，按照2.2項(xiàng)的方法，自“用手持勻漿機(jī)高速攪拌2 min”起，同法制備。

按照2.3項(xiàng)的方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。

表1　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相關(guān)系數(shù)及回歸方程

2.4.3精密度考察

按照2.4.2加標(biāo)回收率中的處理方法，添加0.5 mL混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，平行制備6份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量RSD。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.4.4檢出限和定量限考察

以回收率試驗(yàn)中的低濃度樣品為例計(jì)算信噪比，根據(jù)3倍信噪比值和10倍信噪比值對(duì)應(yīng)的黃曲霉毒素含量，計(jì)算檢出限和定量限。

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢出限和定量限試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

3　結(jié)果與分析

3.1　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

由表1可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在各自濃度范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均≥0.998 5。

3.2　加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的回收率在87%～108%之間，方法準(zhǔn)確可靠，可用于天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測(cè)定。

3.3　精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的精密度試驗(yàn)RSD分別為1.3%、0.9%、3.5%、2.9%，精密度良好。

3.4　檢出限和定量限試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知：檢出限和定量限試驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定，該檢測(cè)方法可用于天麻藥材中黃曲霉毒素的定量測(cè)試。

4　不同產(chǎn)地天麻藥材中黃曲霉毒素的含量測(cè)定結(jié)果

按上述制定的檢測(cè)方法，對(duì)6個(gè)產(chǎn)地共13個(gè)批次的天麻藥材中的黃曲霉毒素含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

由表5可知：全部批次均未檢測(cè)出黃曲霉毒素，結(jié)果符合以下規(guī)定：（1）《中國(guó)藥典》（2015年版），黃曲霉毒素B1≤5 μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量≤10μg/kg；（2）《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，黃曲霉毒素B1≤5 μg/kg；（3）《美國(guó)藥典》，植物藥中的黃曲霉毒素B1≤5μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量≤20 μg/kg。

表2　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2加標(biāo)回收率

表3　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2檢出限和定量限試驗(yàn)結(jié)果

5　結(jié)語(yǔ)

（1）本研究在前處理階段采用50%乙腈水溶液提取的方法，經(jīng)過(guò)加鹽分層，可以去除大部分的水溶性雜質(zhì)，降低水溶性雜質(zhì)對(duì)免疫親和柱的干擾。同時(shí)，使用淋洗液可以促進(jìn)提取液中雜質(zhì)成分的溶解，降低其在免疫親和柱上的吸附，從而提高免疫親和柱的純化效果，減少雜質(zhì)干擾，有助于實(shí)現(xiàn)天麻中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量檢測(cè)。

（2）本研究無(wú)需使用微孔濾膜或玻璃纖維濾膜過(guò)濾，降低了實(shí)驗(yàn)成本，減少了前處理時(shí)間。

（3）本研究共收集了6個(gè)主產(chǎn)區(qū)的13批天麻藥材，均未檢測(cè)出黃曲霉毒素，表明經(jīng)規(guī)范生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸及貯存的天麻不易受黃曲霉菌的侵染。