高分子量麥谷蛋白亞基HPCE高效分離及圖譜鑒定

王衛(wèi)東 高 翔 趙丹陽(yáng)

西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 陜西楊凌 712100

胚乳貯藏蛋白是決定小麥加工品質(zhì)的重要因素,它主要包括麥谷蛋白和醇溶蛋白[1]兩大類。依據(jù)電泳遷移率, 可將麥谷蛋白進(jìn)一步分為高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS)。研究表明, 小麥品質(zhì)變異的30%～79%歸因于編碼HMW-GS等位基因的變化[2]。普通小麥一般有 3～5個(gè) HMW-GS, 由1A、1B、1D染色體長(zhǎng)臂上的Glu-1位點(diǎn)編碼, 每個(gè)位點(diǎn)含有兩個(gè)緊密連鎖的基因, 分別編碼分子量較大的 x-型亞基和分子量較小的 y-型亞基[3]。HMW-GS的組成與面包烘烤品質(zhì)密切相關(guān), 其快速、準(zhǔn)確的分離與鑒定已成為小麥品質(zhì)研究的重要環(huán)節(jié)。

用于 HMW-GS分離鑒定的常規(guī)方法主要包括SDS-PAGE、分子標(biāo)記、RP-HPLC 等[4-7]。SDS-PAGE是最常用的鑒定方法, 其操作簡(jiǎn)單、成本較低, 但是對(duì)于遷移率比較接近的亞基難以準(zhǔn)確鑒別, 且分離所需時(shí)間較長(zhǎng)。分子標(biāo)記技術(shù)鑒定準(zhǔn)確性高, 但受限于標(biāo)記種類且往往需要與SDS-PAGE相結(jié)合檢驗(yàn)基因是否表達(dá)。RP-HPLC技術(shù)選擇性好, 檢測(cè)靈敏度高, 但同樣存在用時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn), 不適宜大量樣品分析。近年來(lái)高效毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)由于其用樣少、速度快、分辨率高等特點(diǎn), 顯示了在HMW-GS的分離與鑒定中良好的應(yīng)用前景。

對(duì)HPCE的分離效率, 已從磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)、硼酸鹽緩沖液系統(tǒng)、乳酸鋁緩沖液系統(tǒng)及 Prosot SDS等方面進(jìn)行了研究[8-12], 驗(yàn)證了其在蛋白定性分析中的可行性, 但是用HPCE分離小麥HMW-GS的研究尚處起步階段, 有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜的研究甚少, 且已報(bào)道的分離體系在分離速度和分辨率上還有待提高。本研究以此為切入點(diǎn), 引入IDA緩沖液系統(tǒng), 通過(guò)分析不同組分濃度、pH對(duì)分離效果的影響并結(jié)合電泳參數(shù)的優(yōu)化, 建立 HPCE高效分離體系, 并以此為基礎(chǔ)研究不同亞基的遷移圖譜, 為小麥 HMW-GS的定性分析及種質(zhì)篩選提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)品種

選用12個(gè)小麥品種, 包括中國(guó)春、西農(nóng)979、濟(jì)南13、晉麥47、濟(jì)麥4號(hào)、豫麥41、煙農(nóng)19、萊州137、魯麥23、矮抗58、豫麥50和鄭麥366。中國(guó)春、西農(nóng) 979、濟(jì)南 13、矮抗 58、豫麥 50由國(guó)家小麥改良中心楊凌分中心品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室提供, 其他品種由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。本課題組前期研究證實(shí)這些品種在 HMW-GS組成上具有多樣性。

1.2 HMW-GS的提取和鑒定

參考Jang等[13]描述的方法, 并稍作修改。取單粒小麥種子, 研磨成粉, 加入 55%異丙醇 1 mL,65°C振蕩沖洗3次, 每次30 min, 充分去除水溶性蛋白及單體醇溶蛋白。向殘余沉淀中加入100 μL提取液(含50%異丙醇, 80 mmol L–1Tris-HCl, pH 8.8,1% DTT), 充分混勻, 65°C水浴30 min, 加入1.4%4-乙烯基吡啶(v/v), 混勻后, 保持同一水浴環(huán)境烷基化反應(yīng)30 min。常溫15 000×g離心15 min, 取上清液加入丙酮, 使其在混合液中的終濃度為 40%,靜置2 h, 15 000×g離心, 棄上清液, 風(fēng)干后沉淀于–20°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

采用 Lee等[14]改良的 SDS-PAGE方法, 利用MV-10DSYS電泳儀對(duì)小麥各品種進(jìn)行HMW-GS的初步鑒定。樣品中加入20 μL提取緩沖液(含2% SDS,0.02%溴酚藍(lán), 0.08 mol L–1Tris-HCl, pH 8.0, 40%甘油), 振蕩混勻, 沸水浴中煮沸5 min, 取8 μL上樣。采用12%分離膠與5%濃縮膠, 12 mA恒流電泳, 指示條帶出膠后繼續(xù)電泳 2 h。使用 1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色過(guò)夜, 脫色至背景清晰, 照相記錄結(jié)果。

用分子標(biāo)記法驗(yàn)證HMW-GS的初步鑒定結(jié)果。取光照培養(yǎng) 1周的幼苗嫩葉, 用CTAB法[15]提取基因組DNA。各亞基基因的分子標(biāo)記信息見(jiàn)表1。

1.3 HPCE高效分離體系的建立

1.3.1 緩沖液系統(tǒng) 將單粒種子所得 HMW-GS樣品, 用200 μL溶解液A (丙三醇15 mL, 尿素18 g,乙酸75 μL, 加ddH2O定容至50 mL)溶解, 然后25°C 超聲(50W)處理 30 min, 充分去除氣泡。使用P/ACE MDQ plus毛細(xì)管電泳儀(BECKMAN, USA)進(jìn)行 HPCE分析, 參考 Robertson等[26]描述的方法,并做適當(dāng)改進(jìn)。新管平衡程序?yàn)?.1 mol L–1NaOH沖洗1 min, ddH2O沖洗2 min, 1 mol L–1H3PO4沖洗1 min, 緩沖液沖洗 5 min。進(jìn)樣前, 用 1 mol L–1H3PO4沖洗 1 min, 0.1 mol L–1NaOH 沖洗 2 min,dd H2O沖洗1 min。兩次樣品間用1 mol L–1H3PO4沖洗30 s, ddH2O沖洗1 min, 緩沖液沖洗1 min。分析緩沖液不同組分濃度及pH對(duì)HMW-GS分離效果的影響。依據(jù)蛋白分析中IDA緩沖液系統(tǒng)條件范圍[27], 設(shè)置2.2、2.5和2.8的pH梯度。IDA濃度為50、75 和 100 mmol L–1。HPMC 濃度為 0.05%、0.50%和不添加。ACN濃度為10%、15%和20%。

表1 HMW-GS分子標(biāo)記Table 1 Molecular markers of HMW-GS

1.3.2 電泳參數(shù) 在相同緩沖液條件下, 比較電泳參數(shù)對(duì)分離效果的影響。常規(guī)電泳參數(shù)為毛細(xì)管內(nèi)徑50 μm, PDA檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm, 分離電壓15 kV,運(yùn)行溫度25°C[28]。優(yōu)化后的電泳參數(shù)為毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm, PDA檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm, 分離電壓20 kV, 運(yùn)行溫度30°C。

1.4 HPCE高效分離體系的驗(yàn)證

1.4.1 連續(xù)重復(fù)電泳 結(jié)合Werner等[9]和余建中[29]的研究結(jié)果初步分析分離圖譜的特點(diǎn)。連續(xù)30次重復(fù)試驗(yàn), 對(duì) HPCE高效分離體系下圖譜峰形、峰高穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.4.2 RP-HPLC分析 與 RP-HPLC比對(duì)分析,驗(yàn)證分離速度, 記錄出峰時(shí)間并計(jì)算 RSD值, 檢驗(yàn)分離重現(xiàn)性。儀器為Agilent 1100 (USA)液相色譜儀及反向高效液相色譜柱(ZORBAX 300SB-C18 Stable Band Analytical 4.6 × 250 mm, 5-Micron)。參照 Dong等[30]描述的方法, 用100 μL溶解液B (21% ACN 0.2 mL, 0.1% TFA)溶解HMW-GS樣品。進(jìn)樣量25 μL,設(shè)置柱溫 60 °C, 流速 1 mol L–1, 洗脫梯度 50 min 內(nèi)流動(dòng)相(0.06% TFA-ACN溶液)的體積比由21%增加到 41%; 相鄰樣品間柱洗滌時(shí)間 15 min; 紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.5 HMW-GS圖譜鑒定

以上述 HPCE高效分離體系為基礎(chǔ), 比較不同類型 HMW-GS的遷移順序及標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間, 為減小誤差, 對(duì)亞基組成相似的品種采用混合進(jìn)樣方式[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種的HMW-GS組成鑒定

SDS-PAGE結(jié)合“Payne標(biāo)準(zhǔn)圖譜”初步鑒定結(jié)果表明, 供試品種在Glu-1A位點(diǎn)的類型有 null、1Ax1和 1Ax2*; 在Glu-1B位點(diǎn)的亞基組合類型有1Bx20、1Bx7+1By8、1Bx7+1By9、1Bx6+1By8、1Bx13+1By16、1Bx17+1By18和 1Bx20+1By20, 除魯麥 23外均成對(duì)亞基; 在Glu-1D位點(diǎn)的亞基組合類型有 1Dx2+1Dy12、1Dx3+1Dy12、1Dx4+1Dy12和 1Dx5+1Dy10 (圖 1-A)。

分子標(biāo)記鑒定與 SDS-PAGE分析結(jié)果一致, 由此確定了供試12個(gè)品種的 HMW-GS的組成, 共包含18個(gè)亞基(圖1-B～F, 表2)。Glu-1A位點(diǎn), 僅豫麥50含1Ax2*亞基, 中國(guó)春、晉麥47和魯麥23為null,其余品種均含1Ax1亞基;Glu-1B位點(diǎn), 中國(guó)春等7個(gè)品種含 1Bx7亞基, 豫麥 41和魯麥 23含 1Bx20,煙農(nóng)19含1Bx17, 萊州137含1Bx6, 中國(guó)春等5個(gè)品種含1By8, 濟(jì)南13、晉麥47和豫麥50含1By9,濟(jì)麥4號(hào)含1By16, 煙農(nóng)19含1By18;Glu-1D位點(diǎn),中國(guó)春等5個(gè)品種含1Dx2亞基, 豫麥41、萊州137和鄭麥366同時(shí)含1Dx5和1Dy10, 其余品種y型亞基均為1Dy12。

2.2 HPCE高效分離體系及其影響因子分析

2.2.1 緩沖液 pH的影響 中國(guó)春有 4個(gè)HMW-GS特征峰, 按出峰時(shí)間由前向后依次為1Dy12、1By8、1Bx7和1Dx2[32-33]。本研究以中國(guó)春為標(biāo)準(zhǔn)樣, 分析緩沖液不同組分濃度及 pH值對(duì)分離效果的影響。

緩沖液系統(tǒng)不同pH值對(duì)HMW-GS峰高、峰寬及基線均有顯著影響。隨著pH值的降低, 亞基峰寬逐漸增大, y型亞基峰高有增大的趨勢(shì), 而x型亞基則相反。pH為2.8和2.2時(shí)均出現(xiàn)不同程度的基線波動(dòng), 尤其是 pH 2.8時(shí), 電泳分離后期有基線上升的趨勢(shì), 1By8亞基有副峰的影響。調(diào)整pH為2.5時(shí)基線狀況最佳, 且亞基分離度較高, 整體遷移速率介于前兩者之間, 4個(gè)特征峰的出峰時(shí)間分別為10.24、11.94、13.40和 15.00 min (圖 2-A)?？梢?jiàn), 緩沖液pH 2.5為最佳條件。

2.2.2 IDA濃度的影響提高IDA濃度, 對(duì)亞基遷移速率有促進(jìn)的作用, 對(duì)亞基峰寬、峰高、分離度及基線影響不大。通過(guò)連續(xù)兩針電泳比較發(fā)現(xiàn),不同IDA濃度對(duì)圖譜重現(xiàn)性有顯著影響。IDA濃度為 100 mmol L–1和 50 mmol L–1時(shí), 連續(xù)兩針電泳亞基出峰時(shí)間均出現(xiàn)了較大的偏差。調(diào)整IDA濃度為75 mmol L–1時(shí), 兩針電泳下亞基主峰幾乎重合, 亞基峰形、峰高均保持較高的一致性, 該濃度下亞基遷移速率介于 50 mmol L–1和 100 mmol L–1之間(圖2-B)。因此, IDA適宜濃度為75 mmol L–1。

圖1 小麥Glu-1位點(diǎn)亞基組成和編碼基因的鑒定Fig. 1 Identification of the subunit composition and coding genes of Glu-1 loci in wheatA: SDS-PAGE分析; B～F: HMW-GS分子標(biāo)記鑒定。M: Trans 2k plus; 1: 中國(guó)春; 2: 西農(nóng)979; 3: 濟(jì)南13; 4: 晉麥47; 5: 濟(jì)麥4號(hào);6: 豫麥41; 7: 煙農(nóng)19; 8: 州 137; 9: 魯麥23; 10: 矮抗 58; 11: 豫麥50; 12: 鄭麥366。A: analysis of SDS-PAGE; B–F: identification of HMW-GS by molecular markers. M: Trans 2k plus DNA marker; 1: Chinese Spring;2: Xinong 979; 3: Jinan 13; 4: Jinmai 47; 5: Jimai 4; 6: Yumai 41; 7: Yannong 19; 8: Laizhou 137; 9: Lumai 23; 10: Aikang 58; 11: Yumai 50;12: Zhengmai 366.

表2 材料品種HMW-GS組成Table 2 Composition of HMW-GS of material varieties

2.2.3 HPMC濃度的影響 HPMC是HPCE分離體系的常用緩沖液添加劑, 不添加 HPMC時(shí), 電泳整體遷移速率最大, 但亞基之間未完全分離, 且峰形不規(guī)則, 峰寬過(guò)大, 顯著影響了圖譜分辨率; 添加HPMC后, 亞基分離度明顯提高, 濃度為0.5%時(shí),亞基峰寬較小, 但基線噪音很大, 當(dāng)調(diào)整濃度為0.05%時(shí), 峰寬增大, 基線噪音顯著減小, 且主峰峰形規(guī)則, 因此圖譜分辨率更高(圖2-C)?？梢?jiàn), HPMC的加入對(duì)分離效率有促進(jìn)作用, 且適宜濃度為0.05%。

2.2.4 ACN濃度的影響 3種ACN濃度下均獲得清晰對(duì)稱的峰形。隨著ACN濃度的減小, 亞基分離度增大, 當(dāng) ACN濃度為 10%時(shí), 分離度最高, 但是亞基峰高有明顯降低, 同時(shí)由于該濃度下峰寬較大, 導(dǎo)致亞基縱向擴(kuò)散與峰展寬的比例過(guò)小, 影響了圖譜分辨率(圖2-D)。ACN濃度為15%和20%時(shí)這一比例差異不大, 但前者分離度更高, 這將有利于其他類型亞基的加入和識(shí)別。因此, 推薦ACN適用濃度為15%。

2.2.5 電泳參數(shù)的影響 參數(shù)優(yōu)化后HPCE圖譜整體遷移速率提高, 分離所需時(shí)間變短, 同時(shí)由于亞基峰高增大、峰寬減小, 亞基縱向擴(kuò)散與峰展寬的比例擴(kuò)大, 圖譜分辨率得到進(jìn)一步提升(圖 3), 在后期分離鑒定遷移率比較接近的亞基時(shí)將更加有利。

綜合考慮各種因子對(duì)分離效果的影響, 確定了最佳緩沖液體系為75 mmol L–1IDA + 0.05% HPMC+ 15% ACN, pH 2.5, 電泳參數(shù)為毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm,PDA檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm, 分離電壓20 kV, 運(yùn)行溫度30°C。據(jù)此建立了小麥HMW-GS的HPCE高效分離體系。

2.3 HPCE高效分離體系驗(yàn)證

與前人報(bào)道一致[9,29], HPCE圖譜中1～2 min為溶劑峰, 3～7 min為少量LMW-GS區(qū)域, HMW-GS區(qū)域始于 9 min (圖 4)。1Dy12、1By8、1Bx7和 1Dx2亞基在16 min內(nèi)全部分離完成。連續(xù)30次電泳, 圖譜峰形及峰高均保持穩(wěn)定, 且基線水平、噪音低, 圖譜分辨率良好。

通過(guò)比較HMW-GS分離度及遷移速度, 發(fā)現(xiàn)本研究建立的HPCE高效分離體系優(yōu)于RP-HPLC (圖5), 更利于鑒別遷移率相近亞基。比較亞基出峰時(shí)間(表3), HPCE高效分離體系相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%以下, 遠(yuǎn)低于RP-HPLC的1.0%以下, 因此分離重現(xiàn)性更高。良好的穩(wěn)定性、分離速度和重現(xiàn)性保證了HMW-GS圖譜鑒定的準(zhǔn)確性。

2.4 HMW-GS圖譜鑒定

中國(guó)春 1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2亞基出峰時(shí)間依次為 9.39、11.70、13.18 和 14.73 min (圖 6-A)。在中國(guó)春HMW-GS的基礎(chǔ)上, 添加西農(nóng)979 (1, 7+8,2+12)混合進(jìn)樣, 在13.73 min處獲得1Ax1亞基主峰,其遷移速率介于 1Bx7和 1Dx2亞基之間(圖 6-B)。繼續(xù)添加濟(jì)南13 (1, 7+9, 2+12)混合進(jìn)樣, 于10.30 min處獲得 1By9亞基特征峰, 其遷移時(shí)間晚于1Dy12 亞基(圖 6-C)。

圖2 緩沖液組分濃度、pH對(duì)HMW-GS電泳分離的影響Fig. 2 Effect of constituent concentration and pH values of buffer on electrophoresis separation of HMW-GS

在中國(guó)春(null, 7+8, 2+12)、西農(nóng) 979 (1, 7+8,2+12)和濟(jì)南 13 (1, 7+9, 2+12)的基礎(chǔ)上(圖 6-D), 添加豫麥50 (2*, 7+9, 2+12)獲得1Ax2*亞基特征峰(圖6-E), 添加晉麥47 (null, 7+9, 3+12)獲得1Dx3亞基特征峰(圖 6-F)。1Ax2*亞基出峰時(shí)間為 13.50 min,該亞基的遷移時(shí)間介于 1Bx7和 1Ax1之間, 且與1Ax1亞基峰比較接近。1Dx3亞基遷移速率略快于1Dx2亞基, 出峰時(shí)間為14.46 min。

將中國(guó)春(null, 7+8, 2+12)與鄭麥 366 (1, 7+8,5+10)混合進(jìn)樣, 在9.69、13.73和14.04 min處獲得3個(gè)特征峰(圖6-G, H)。已知13.73 min為1Ax1亞基,14.04 min主峰面積大于9.69 min, 并且同一位點(diǎn)上x(chóng)型亞基的含量大于y型亞基[3], HPCE圖譜中峰面積大小代表了亞基含量的高低, 因此可知, 9.69 min為1Dy10亞基, 14.04 min為1Dx5亞基。同理, 繼續(xù)添加豫麥41 (1, 20x+20y, 5+10)進(jìn)樣, 在12.22 min和12.62 min獲得兩個(gè)新的特征峰(圖6-I), 前者峰面積較小, 為1By20亞基, 后者為1Bx20亞基。

向中國(guó)春、鄭麥366混合樣中添加萊州137, 獲得1Bx6亞基峰, 出峰時(shí)間為13.08 min, 遷移速率與緩沖液成分: 75 mmol L–1IDA + 0.05% HPMC + 15% ACN, pH 2.5。優(yōu)化前電泳參數(shù): 毛細(xì)管內(nèi)徑50 μm, PDA檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm,分離電壓15 kV, 運(yùn)行溫度25°C; 優(yōu)化后電泳參數(shù): 毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm, PDA檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm, 分離電壓 20 kV, 運(yùn)行溫度30°C。Buffer constituents: 75 mmol L–1IDA + 0.05% HPMC + 15% ACN,pH 2.5. Electrophoresis parameters were 50 μm of the inner diameter of capillary, 214 nm of detection wavelength, 15 kV of separation voltage, and 25°C of operating temperature before optimization and 25 μm of the inner diameter of capillary, 200 nm of the detection wavelength, 20 kV of separation voltage, and 30°C of operating temperature after optimization.1Bx7亞基很接近(圖6-J, K)。繼續(xù)添加魯麥23同樣獲得了1Bx20亞基峰(圖6-L), 與圖6-I鑒定結(jié)果一致。

圖3 電泳參數(shù)優(yōu)化前(A)和優(yōu)化后(B)的HPCE圖譜Fig. 3 HPCE profile before (A) and after (B) optimization of electrophoresis parameters

圖4 中國(guó)春HMW-GS連續(xù)30次HPCE分離Fig. 4 Thirty separations of HMW-GS of Chinese Spring by HPCE圖中曲線分別對(duì)應(yīng)第1、5、10、15、20、25和30次電泳分離。The curves correspond to the 1st, 5th, 10th, 15th, 12th, 25th, and 30th electrophoresis separation, respectively.

向中國(guó)春與西農(nóng)979混合樣中添加矮抗58, 確定了 1Dx4亞基峰, 其遷移速率介于 1Ax1與 1Dx2之間, 出峰時(shí)間為14.24 min (圖6-M, N)。向中國(guó)春、西農(nóng)979、矮抗58混合樣分別添加濟(jì)麥4號(hào)和煙農(nóng)19, 并比較新加入峰面積, 獲得 1By16、1Bx13、1By18和1Bx17亞基特征峰(圖6-O, P), 出峰時(shí)間分別為12.09、12.83、11.89和12.36 min。

圖5 HPCE (A)與RP-HPLC (B)的分離圖譜Fig. 5 Separation profile of HPCE (A) and RP-HPLC (B)

表3 HMW-GS出峰時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Relative standard deviation and peak time of HMW-GS

圖6 不同HMW-GS的HPCE圖譜(混合進(jìn)樣)Fig. 6 HPCE spectrum of different HMW-GS (mixed injection)

獲得的18個(gè)亞基的標(biāo)準(zhǔn)圖譜, 亞基遷移順序?yàn)?Dy12→1Dy10→1By9→1By8 → 1By18 → 1By16→1By20 → 1Bx17 → 1Bx20 →1Bx13→1Bx6→1Bx7→1Ax2*→1Ax1→1Dx5→1Dx4→1Dx3→1Dx2, 標(biāo) 準(zhǔn)出峰時(shí)間如表4所示, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%以下。以1Bx17為分界線, 9.39 min到12.36 min為y型亞基區(qū)域, 12.36 min到14.76 min為x型亞基區(qū)域。

表4 18個(gè)HMW-GS的出峰時(shí)間Table 4 Peak time of eighteen HMW-GSs

3 討論

準(zhǔn)確有效地鑒定 HMW-GS將有助于加快品質(zhì)改良步伐。HPCE技術(shù)在分離速度、分辨率等方面很大程度克服了傳統(tǒng)方法的不足。

HPCE中分離體系的構(gòu)建是研究亞基標(biāo)準(zhǔn)圖譜的前提。體系中緩沖液系統(tǒng)是影響分離效果的主要因素, Bean和Lookhart[12]最早將IDA緩沖系統(tǒng)引入HPCE, 主要對(duì)醇溶蛋白的分離進(jìn)行分析。本研究將IDA引入 HMW-GS的 HPCE分析, 通過(guò)優(yōu)化條件,獲得了良好的分離效果, 與常規(guī)的磷酸鹽、硼酸鹽、乳酸鋁及 Prosot SDS緩沖液系統(tǒng)[8-12]相比, 在分離重現(xiàn)性上更具有優(yōu)勢(shì), 結(jié)合電泳參數(shù)的優(yōu)化, 亞基出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在0.2%以下, 誤差范圍在±0.02 min內(nèi), 從而保障了標(biāo)準(zhǔn)圖譜分析的精確性。

在優(yōu)化分離體系時(shí), 緩沖液系統(tǒng)各組分濃度及pH值主要通過(guò)改變電滲流而影響分離[35]。小麥HMW-GS屬于大分子蛋白[36], 極易吸附于毛細(xì)管內(nèi)壁, 極端pH可以產(chǎn)生抑制作用[37], 穩(wěn)定溶液電滲流,實(shí)驗(yàn)中pH 2.8時(shí)電泳后期有基線上升的現(xiàn)象, 推測(cè)可能是該條件下抑制作用急劇下降, 使毛細(xì)管內(nèi)產(chǎn)生了較多的焦耳熱。IDA同樣具有穩(wěn)定電滲流的作用, 因此與分離重現(xiàn)性密切相關(guān)。Machiste等[38]認(rèn)為加入HPMC明顯提高緩沖液的分離效率, 因此可將HPMC作為添加劑使用。本研究印證了這一觀點(diǎn)。在本研究中, ACN濃度升高將會(huì)使分離度下降, 其原因可能是ACN對(duì)電滲流的影響加快了樣品堆積[39]。

在亞基標(biāo)準(zhǔn)圖譜研究中, 本研究采用控制變量混合進(jìn)樣分離[31]的方式, 有助于減小試驗(yàn)誤差。Werner等[9]、Sutton 和 Bietz[11]利用 ProSort SDS 商用試劑進(jìn)行小麥 HMW-GS的 HPCE分析, 獲得了1Ax1、1Dx2、1Bx7、1By8、1By9、1Dy10、1Dy12、1Bx17、1By18等亞基的遷移圖譜, 出峰時(shí)間 RSD在3%左右。亞基遷移順序表現(xiàn)為1Dy12→1Dy10→1By9→1By8→1By18→1Bx17→1Bx7→1Ax1→1Dx2,但對(duì)1Dy12與1Dy10、1By9與1By8等遷移率比較接近的亞基分離度不高。本研究增加了圖譜中能夠表征的亞基類型, 上述亞基出峰順序與前人結(jié)果[9,11]一致, 但是遷移速率上略有差異, 在出峰時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差降低的同時(shí), 亞基分離度獲得了提升。

與SDS-PAGE類似, HPCE圖譜中具有明顯的x型、y型亞基分界, 整體上表現(xiàn)為 y型亞基先洗脫,然后是 x型亞基。Salmanowicz等[33]研究表明,HMW-GS中y型亞基的pI為6.70～6.98, 近中性, 而x型亞基 pI為 4.72～5.23, 呈弱酸性, 在毛細(xì)管高壓電場(chǎng)下, 堿性或近中性亞基的遷移時(shí)間比弱酸性亞基短。本研究發(fā)現(xiàn), 1Ax1和1Ax2*的遷移速率均大于1Dx5, 與在SDS-PAGE中截然不同[40]。這可能與該類型亞基在兩種分離環(huán)境中所處的分子形態(tài)有關(guān),Werner等[9]也認(rèn)為,Glu-1A位點(diǎn)亞基在CE動(dòng)態(tài)篩分環(huán)境和SDS-PAGE固定孔篩分裝置中分子形態(tài)的不同是導(dǎo)致分離速率差異的主要因素。

結(jié)合亞基遷移順序、標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間及電泳圖譜等, 可對(duì)小麥相關(guān) HMW-GS進(jìn)行 HPCE快速鑒定,為大規(guī)模種質(zhì)資源篩選提供技術(shù)條件, 同時(shí)由于亞基在 HPCE圖譜中是以峰的形式出現(xiàn), 且對(duì)應(yīng)具體的遷移時(shí)間, 因此亦可對(duì)新HMW-GS進(jìn)行初步鑒別。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)緩沖液系統(tǒng)組分濃度、pH及電泳參數(shù)的優(yōu)化, 成功構(gòu)建了小麥HMW-GS的HPCE高效分離體系, 該體系具有良好的分離效率及分離重現(xiàn)性。以此為基礎(chǔ), 獲得了1Dy12、1Dy10、1By9、1By8、1By18、1By16、1By20、1Bx17、1Bx20、1Bx13、1Bx6、1Bx7、1Ax2*、1Ax1、1Dx5、1Dx4、1Dx3和1Dx2共18個(gè)亞基的標(biāo)準(zhǔn)圖譜, 依據(jù)亞基遷移順序、標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間及圖譜特點(diǎn)可以進(jìn)行HMW-GS的HPCE快速鑒定。